一种用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法技术

本发明专利技术属于化妆品新原料的功效评价技术领域，尤其涉及一种用于β

【技术实现步骤摘要】
一种用于
β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法


[0001]本专利技术属于化妆品新原料的功效评价
，尤其涉及一种用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法。

技术介绍

[0002]2009年
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2019年这10年里，我国获批上市的化妆品新原料只有4个，自2021年《化妆品监督管理条例》实施后，化妆品新原料的成功备案取得了突破性进展。2021年5月1日，为贯彻落实《化妆品监督管理条例》，规范和指导化妆品功效宣称评价工作，国家药监局宣布施行《化妆品功效宣称评价规范》(以下称《规范》)，要求应当依据《规范》的要求对化妆品的功效宣称进行评价。但并未规定具体的功效评价方法，也没有相应的标准规范。
[0003]β
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烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide)，简称“NMN”，是一种自然存在的生物活性核苷酸，可作为化妆品原料添加，是细胞保持活力的重要支撑，具有抗衰老的重要功能。自2022年1月份首家公司的β
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烟酰胺单核苷酸获批化妆品新原料以来，已有三家公司的β
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烟酰胺单核苷酸作为化妆品新原料备案成功。对该原料进行全面快速的风险评估和评价成为推动备案的重要因素。除了理化和安全性检测外，对该原料的功效评价也成为了在新原料备案过程中亟需解决的问题。对于抗衰老体外评价方法，目前现有技术中通过对抗氧化性、防晒性辅助进行评价，采用的方法包括紫外扫描法、紫外吸光度法DPPH、自由基清除试验等化学方法和L929成纤维细胞细胞周期检测、凋亡检测、B16黑色素瘤增殖力检测等体外细胞方法，以及动物试验评价方法。然而，上述现有技术中的方法存在不够直观，重复性差、操作相对复杂等问题。根据化妆品功效宣称评价项目要求，抗衰老功效可采用人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验三种方法中任一种方法进行评价，相较于其它两种技术方法，建立合适的实验室体外评价方将极大地推动备案进程，更符合人体伦理。此外体外试验室方法具有用时短、成本低、可用于广泛初筛等优点。
[0004]人角质形成细胞，是构成表皮的主要细胞成分，是由于外胚层分化而来。角质形成细胞通过细胞间桥紧密连接在一起。角质形成细胞的特征为在分化过程中可产生角蛋白，能够连续不断地分化与增殖，从而使新生的细胞与脱落的角质细胞维持平衡，以维持表皮正常厚度，延缓衰老。对皮肤生物学研究发现，延长角质形成细胞的增殖倍数，加速其增殖，能够有效抑制皮肤衰老。故而人角质形成细胞可以作为化妆品及原料抗衰老功效评价的有效模型，通过受试物孵育后检测细胞的增殖率的变化，来评价受试物对人角质形成细胞增殖的影响，从而评价化妆品或化妆品原料的抗衰功效。

技术实现思路

[0005]为解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，本专利技术采用一种商业化的细胞株系
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人角质形成细胞(HaCaT)来构建体外评价模型，通过优化试验条件，对细胞增殖力进行测定来评价β
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烟酰胺单核苷酸的抗衰老功效。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，具体操作步骤如下：
[0008](1)受试物的制备：用RPMI
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1640培养液配制成不同浓度的受试物溶液。
[0009](2)HaCaT细胞的培养：
[0010]用完全培养液1培养HaCaT细胞至对数增长期；
[0011]用0.25％胰蛋白酶
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乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加完全培养液2稀释至每1ml中含5*104～1*105个细胞得到细胞悬液；
[0012]将上述细胞悬液在96孔细胞板上铺板，每孔100ul，其中留3孔加10％小牛血清培养液100ul作为空白对照，置于37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3～4小时使其贴壁。
[0013](3)抗衰老活性检测：
[0014]受试物组：每孔加受试物溶液100ul，每个浓度均做3孔。
[0015]细胞对照组和空白对照组：每孔分别加RPMI
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1640培养液100ul。
[0016]置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时，结束前4小时取出培养板，吸取培养液，每孔加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)洗一次，然后再在每孔中加入完全培养液200ul和MTT溶液20ul，继续置于37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养4h。
[0017](4)抗衰老活性评价：
[0018]培养结束后，吸出培养液，每孔加入100ul二甲基亚砜，室温摇匀，在酶标仪上以490nm的波长处分别测定其吸收度A值，按照下式进行计算增殖指数。
[0019][0020]通过在某浓度范围内增殖指数与细胞对照组是否有显著性差异来评价抗衰老活性。用SPSS软件或其他统计学软件进行统计和显著性分析，P＜0.05表示具有显著性差异。受试物组与细胞对照组相比，增殖率＞100％，且P＜0.05，可判定受试物具有抗衰老功效。
[0021]有益效果
[0022]本专利技术公开了一种用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，本专利技术采用一种能模拟人表皮细胞的细胞株系——HaCaT细胞，是一种商业化传代细胞系，可来源于各个细胞保藏中心购得。该专利技术采用一种更简便的体外细胞评价方法代替人体及动物试验来评价β
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烟酰胺单核苷酸的抗衰老功效，符合实验动物“3R”原则，测试方法经济快捷，测试过程可控，标准化程度高，避免了生物体个体差异引起的结果偏差。本专利技术通过将受试物孵育培养基和细胞培养基区分开来，提高了检测重复性，解决了β
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烟酰胺单核苷酸使用常规MTT细胞增殖检测试验体系进行抗衰老活性评价检测结果不理想的问题，构建了一种快速、低成本的β
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烟酰胺单核苷酸体外抗衰老活性评价方法。
附图说明
[0023]图1：β
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烟酰胺单核苷酸对HaCaT细胞存活率的影响图；
[0024]图2：显微镜下对照组与0.44mg/ml受试物组的细胞照片；
[0025]图3：溶剂系统的影响图；
[0026]图4：异栎素对HaCaT细胞存活率的影响图；
[0027]图5：放置不同时间的β
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烟酰胺单核苷酸溶液对HaCaT细胞存活率的影响图。
具体实施方式
[0028]以下，将详细地描述本专利技术。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许专利技术人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本专利技术的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)受试物的制备：用完全培养液2将受试物配制成一定浓度的受试物溶液，备用；(2)HaCaT细胞的培养：一定条件下对HaCaT细胞进行培养，得到HaCaT细胞培养液，备用；(3)抗衰老活性检测：将步骤(1)所得受试物溶液加入步骤(2)中的HaCaT细胞培养液中，一定条件下进行培养；(4)抗衰老活性评价：培养结束后，吸出培养液，加入二甲基亚砜，摇匀，在酶标仪上以490nm的波长处分别测定其吸收度A值，按照下式进行计算增殖指数：通过在某浓度范围内增殖指数与细胞对照组是否有显著性差异来评价抗衰老活性；通过MTT溶液检测细胞增值率。2.根据权利要求1所述的用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养液为RPMI
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1640培养液。3.根据权利要求1所述的用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述HaCaT细胞的培养具体包括以下步骤：用完全培养液1培养HaCaT细胞至对数增长期；用0.25％胰蛋白酶
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乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加完全培养液2稀释至每1ml中含5*104～1*105个细胞，得到细胞悬液；将上述细胞悬液在多孔细胞板上铺板，其中留3孔加10％新生牛血清培养液作为空白对照，置于37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3～4小时使其贴壁。4.根据权利要求3所述的用于β
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烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，所述完全培养液1的配制方法为：取含谷氨酰胺的RPMI
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1640培养基900ml，加已灭活的新生牛血清100ml；所述完全培养液2的配制方法为：取不含谷氨酰胺的RPMI

【专利技术属性】
技术研发人员：耿雪，祝清芬，周倩，刘娜，魏霞，
申请(专利权)人：山东省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：