基于GFP标记的梨火疫病菌监测其在果树组织中的侵染定殖和迁移特征中的应用制造技术

本发明专利技术公开了基于GFP标记的梨火疫病菌监测其在果树组织中的侵染定殖和迁移特征中的应用，涉及植物病理学技术领域。本发明专利技术利用梨火疫病菌的GFP标记菌株，针对梨树的枝条、叶片和根组织分别采用针刺、喷雾和灌根法接种，采用对接种的植物组织材料测量病斑，选择培养基分离培养并结合荧光菌落的鉴别，定量检测梨火疫病菌在寄主不同组织中侵染定殖的活菌数量、迁移时间及速率。通过显微影像直观监测病原菌在寄主不同组织内的扩展分布和侵染过程。本发明专利技术具有取材方便，可操作性强，简便易行，直观可视，结果准确，检测周期短，重复性好的优点。重复性好的优点。重复性好的优点。

【技术实现步骤摘要】
基于GFP标记的梨火疫病菌监测其在果树组织中的侵染定殖和迁移特征中的应用


[0001]本专利技术涉及植物病理学
，特别是涉及基于GFP标记的梨火疫病菌监测其在果树组织中的侵染定殖和迁移特征中的应用。

技术介绍

[0002]由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)侵染引起的梨火疫病是严重危害梨、苹果、山楂、海棠等仁果类果树生产的毁灭性细菌病害。
[0003]针对梨火疫病现有的防治措施包括化学防治、生物防治、果园清洁、抗病品种选育等。但目前果树抗病品种匮乏，缺少专门的防治药剂，也没有能高效控制病害的单一措施，病害的防治成为世界性的难题。研究表明，E.amylovora具有一些不同于其他细菌病害的独特的侵染特征是其造成果树毁灭性危害的重要因素。病原菌通过伤口和自然孔口侵入寄主植物，在条件适宜时病原菌从受侵染的花、叶片、嫩梢等部位迅速扩散，迁移到大枝、主枝，严重时可沿树干迁移动到砧木和根部并最终造成果树全株死亡，导致多年栽培的果园被毁。病原菌可在果树枝干的溃疡斑、枝条和病果，以及不表现症状的组织上越冬，春季在病灶处大量繁殖成为当年的初侵染源，通过风雨、昆虫、鸟类及田间操作将病原菌传至花造成初次侵染，进一步感染叶片、嫩稍造成再次侵染。因此，及时修剪发病果树的病枝，不仅可以大大降低病原菌的菌源量，还能阻止其在树体中的迁移扩展，是简便易行、经济有效的病害防控的重要措施。在病枝修剪中，既要及时将有病原菌存在的发病枝条彻底清除，又要尽可能的保留健康组织，明确病枝条修剪的位置、长度、范围及时间等是一个关键的技术问题。曾有国外学者认为，对2年生以上发病枝条在可见病斑症状的组织向下20
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30cm处剪除，但未提出明确的依据。病原菌在寄主组织中的侵染定殖、分布及迁移特征受寄主植物的种类、品种、组织、树龄、生长时期等多因素的影响。近年来的研究发现，梨火疫病菌除了可从寄主的地上部分组织侵染外，在土壤和灌溉水中的E.amylovora还能从根部侵入，根部侵染是病原菌入侵的另一个途径。但土壤中的病原菌如何从根部侵入，从根部入侵的病原菌如何传导以及是否是造成主干枯死的原因都是需要研究明确的问题。因此，建立适宜可靠的方法，追踪研究梨火疫病菌在组织内的侵染定殖和迁移特征，对于掌握病害的发生流行规律，解析致病机制，制定科学高效的病害防控措施密切相关。
[0004]国外研究者曾对梨火疫病菌的侵入及在在寄主体内的转移扩展采用生物学、细胞学和组织学的方法开展过一些研究。但由于该病原菌寄主种类的多样性和研究技术及手段的局限性，仍然存在诸多问题：示踪病原菌在寄主中的侵染定殖，在成熟的树木材料上接种病原菌难以操作、发病率低且不稳定；在实验室采用果树幼苗或小植株做接种材料，病原菌侵染后的症状发展不具有代表性；通过PCR技术检测寄主组织中的病原菌是针对特异性的DNA片段而不是病原菌细胞，且不能区分死活菌体，无法判断其在病害传播流行中的意义；对不表现症状的植物组织中的病原菌检测也是难点。总之，由于缺少适宜的技术和方法，一直没有获得确定的结果，急需创建一套可在田间对梨火疫病菌在寄主组织中的侵染、定殖
和扩展动态进行原位检测的准确可靠、简便易行的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供基于GFP标记的梨火疫病菌监测其在果树组织中的侵染定殖和迁移特征中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用本专利技术的方法可以有效掌握梨火疫病菌在寄主组织中的侵染定殖、分布和迁移扩展规律，为制定准确修剪病枝指标和制定综合防控措施提供科学依据。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供基于GFP标记的梨火疫病菌株监测其在果树组织中的侵染定殖和迁移特征中的应用。
[0008]进一步地，所述果树为蔷薇科仁果类果树。
[0009]本专利技术还提供一种监测梨火疫病病菌在果树组织中的侵染定殖和迁移特征的方法，包括：将梨火疫病菌GFP标记菌株接种于果树枝条、叶片和根组织，监测其在接种组织中的侵染过程、定殖量和定殖分布，以及迁移距离、时间和速度。
[0010]进一步地，所述枝条的接种方法为针刺法或喷施法；所述叶片的接种方法为针刺法或喷施法；所述根组织的接种方法为灌根法。
[0011]进一步地，将梨火疫病菌GFP标记菌株接种于果树枝条、叶片和根组织的具体操作包括：将所述GFP标记的梨火疫病菌株发酵培养后，用无菌水稀释成接种液，再接种于果树枝条、叶片和根组织。
[0012]进一步地，所述接种液的浓度为106～109CFU/mL。
[0013]进一步地，所述定殖量通过平板计数的方法测定。
[0014]进一步地，所述定殖分布通过制作组织切片，在共聚焦扫描显微镜下观察得到。
[0015]进一步地，所述侵染过程通过体式荧光显微镜或扫描电子显微镜下观察获得。
[0016]进一步地，监测梨火疫病菌的迁移距离、时间和速度的方法为：接种后每天检查接种组织的发病情况，测定病斑扩展的长度、时间和迁移速度。
[0017]本专利技术公开了以下技术效果：
[0018]本专利技术采用报告基因GFP标记的梨火疫病菌示踪其在梨树及其他寄主果树组织中的定殖和迁移特征，其技术优点表现在：
[0019](1)接种材料多样易取。既可以选择果园果树上1～2年生的枝条、叶片，也可以用温室栽培的盆栽苗木，也可以采集果树上的枝条、叶片，在离体条件下接种，保证了材料取材方便，均匀一致。
[0020](2)接种方法高效简便。针对病原菌对不同组织的侵染特点，分别采用了针刺、喷雾和灌根的不同接种方法，确保接种发病率高、发病快，试验周期短，可重复性高。
[0021](3)试验条件可控。监测试验既可以在果园开展反映在田间自然环境下的病原菌侵染和迁移特点，也可以在温室、实验室内设置的不同条件下开展，评价在不同环境条件下的病原菌侵染和迁移规律。
[0022]本专利技术既可以准确获取梨火疫病菌在寄主不同组织中侵染定殖的数量、迁移速度、迁移时间及速率的数据，又可以通过显微影像直观形象地观察病原菌在寄主不同组织内的分布和侵染过程。本专利技术技术先进，创新性突出，对于明确梨火疫病菌在寄主组织中的
侵染定殖、分布和迁移扩展规律，制定准确修剪病枝指标和制定综合防控措施提供了科学依据。同时，在梨火疫病菌致病力的测定，抗病果树品种的选育，病害防病效果评价中都有重要的应用价值。
[0023]本专利技术采用GFP标记的梨火疫病菌菌株监测其在梨树组织中的定殖和迁移特征的方法，同样可以在梨火疫病菌寄主苹果、山楂、海棠、杜梨等蔷薇科仁果类果树上应用。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为梨火疫病菌GFP标记菌株E.a 0055...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于GFP标记的梨火疫病菌监测其在果树组织中的侵染定殖和迁移特征中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述果树为蔷薇科仁果类果树。3.一种监测梨火疫病病菌在果树组织中的侵染定殖和迁移特征的方法，其特征在于，包括：将梨火疫病菌GFP标记菌株接种于果树枝条、叶片和根组织，监测其在组织中的侵染过程、定殖量和定殖分布，以及迁移距离、时间和速度。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述枝条的接种方法为针刺法或喷施法；所述叶片的接种方法为针刺法或喷施法；所述根组织的接种方法为灌根法。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将梨火疫病菌GFP标记菌株接种于果树枝条、叶片和根组织的具体操作包括：将所述GFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗明，徐琳赟，吕天宇，韩剑，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：