一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法，包括以下步骤：1)用染色缓冲液重悬样本细胞，再加入死/活染料，流式抗体，常温避光染色；2)加入染色缓冲液，离心；3)加入染色缓冲液重悬细胞，于流式细胞仪中进行检测。本发明专利技术方法通过细胞表面标志物LYVE1、TIMD4共同筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群，结果精准明确，为后续进一步研究人的脂质缓冲巨噬细胞与2型糖尿病的关系提供了技术支持。巨噬细胞与2型糖尿病的关系提供了技术支持。巨噬细胞与2型糖尿病的关系提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法。

技术介绍

[0002]肥胖的流行推动2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)发病率的迅速增高，带来巨大的社会经济负担。脂肪组织是与肥胖关系最为密切的组织器官。随着肥胖的发展，脂肪组织扩张，并发生功能障碍，促进胰岛素抵抗和T2DM的发生。脂肪组织功能障碍的重要特征是免疫细胞浸润引发的组织炎症，而巨噬细胞是脂肪组织含量最为丰富的免疫细胞，也是炎症因子的主要来源，与T2DM的发生密切相关。
[0003]巨噬细胞是一种高度异质性的细胞群体，由多个具有不同功能的细胞亚群组成。例如，M1型巨噬细胞通过分泌促炎因子推动炎症和T2DM的发展。除此之外，近年的多项研究提示具有脂质缓冲功能的巨噬细胞也参与糖代谢调控。动物研究已经确定了小鼠脂肪组织中参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群，这些巨噬细胞可以防止代谢异常的发生。与之相对的是，临床研究提示人脂肪组织中富含脂质的巨噬细胞与胰岛素抵抗呈正相关。然而，目前尚无在人内脏脂肪组织中筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法和应用，也就无法进一步研究人的脂质缓冲巨噬细胞与2型糖尿病的关系。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术期望提供一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法，通过特异的细胞表面标志物针对性高效筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群，为进一步研究人的脂质缓冲巨噬细胞与2型糖尿病的关系。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法，包括以下步骤：
[0007]1)用染色缓冲液重悬样本细胞，再加入死/活染料，流式抗体，常温避光染色；
[0008]2)加入染色缓冲液，离心；
[0009]3)加入染色缓冲液重悬细胞，于流式细胞仪中进行检测。
[0010]进一步地，所述染色缓冲液为加入1％体积胎牛血清的磷酸盐缓冲液。
[0011]进一步地，所述步骤1)或3)染色缓冲液为200μL；所述步骤2)染色缓冲液为1mL，400g离心5min。
[0012]进一步地，所述步骤1)加入死活染料0.2μL，流式抗体各2μL。
[0013]进一步地，所述步骤1)中流式抗体包括LYVE1，TIMD4。
[0014]这里，LYVE1、TIMD4两种抗体特异性筛选脂质缓冲的巨噬细胞亚群，有利于高效精准地分析人内脏脂肪组织巨噬细胞，为进一步研究提供强大的技术支持。
[0015]进一步地，所述步骤1)中流式抗体包括CD45，CD11B，CD3，CD19，CD56，CD1C，LYVE1，TIMD4，CD48。
[0016]进一步地，所述步骤1)中常温避光染色20min。
[0017]本专利技术有益效果如下：本专利技术方法通过细胞表面标志物LYVE1、TIMD4共同筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群，结果精准明确，为后续进一步研究人的脂质缓冲巨噬细胞与2型糖尿病的关系提供了技术支持。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例2中脂质摄取能力检测结果图；
[0019]图2为本专利技术实施例2中胞内脂质含量检测结果图。
具体实施方式
[0020]为了能够更加详尽地了解本专利技术的特点与
技术实现思路
，下面结合附图对本专利技术的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本专利技术。
[0021]实施例1鉴定人内脏脂肪组织巨噬细胞亚群构成，筛选合适抗体
[0022](1)于腹部手术过程中获得患者大网膜脂肪组织，置于完全培养基中(培养基+10％胎牛血清+1％双抗)，在冰上暂存。
[0023](2)取5g脂肪组织，剪碎成约1mm3的小块，转移到50mL离心管中，定容到30mL。
[0024](3)加入0.1％的2型胶原酶，37℃消化45min。
[0025](4)加入20mL完全培养基终止消化，400g离心5min；
[0026](5)弃去上层油滴和成熟脂肪细胞碎片，以及中层的酶溶液，将沉淀重悬。
[0027](6)100μm筛网过滤，400g离心5min。
[0028](7)弃去上清，裂解红细胞，重悬，得到血管基质成分单细胞悬液。
[0029](8)将红细胞裂解样本进行转录组基因提取，使用3'Library and Gel Bead Kit V3试剂盒，货号为1000075，以及Chromium Single Cell B Chip Kit试剂盒，货号为1000074，送10x Genomics公司进行单细胞测序。
[0030]结果显示，脂肪组织巨噬细胞鉴定为四个独特的亚群：LYVE1
+
TIMD4
+
,LYVE1
+
TIMD4
‑
,CD48
+
LYVE1
‑
,CD48
‑
LYVE1
‑
，每个亚群具有特异性的基因表达谱，其中一群LYVE1
+
TIMD4
+
的巨噬细胞特征性表达多个参与吞噬和脂质摄取过程的基因，如MARCO,TIMD4等，参与脂质缓冲，为吞噬性巨噬细胞(Phagocytic macrophages,PMs)。据此选择LYVE1，TIMD4作为流式抗体，用于筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群。
[0031]实施例2通过流式抗体LYVE1、TIMD4，筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群
[0032](1)用200μL染色缓冲液(磷酸盐缓冲液中加入1％体积的胎牛血清)重悬血管基质成分单细胞，加入死/活染料0.2μL，CD45，CD11B，CD3，CD19，CD56，CD1C，LYVE1，TIMD4，CD48流式抗体各2μL，常温避光染色20min。
[0033](2)加入1mL染色缓冲液，400g离心5min。
[0034](3)200μL染色缓冲液重悬细胞，于流式细胞仪中进行检测。
[0035]本实施例中，经流式细胞仪分析，结果得到CD45
+
CD11B
+
CD3
‑
CD19
‑
CD56
‑
CD1C
‑
的总巨噬细胞，包括四个巨噬细胞亚群：LYVE1
+
TIMD4
+
,LYVE1
+
TIMD4
‑
,CD48
+
LYVE1
‑
,CD48
‑
LYVE1
‑
细胞群，结果精准，同时实现了参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的分析和分选。
[0036]图1为本专利技术实施例2中脂质摄取能力检测结果图，图2为本专利技术实施例2中胞内脂
质含量检测结果图，四个亚群分析结果如图1、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用染色缓冲液重悬样本细胞，再加入死/活染料，流式抗体，常温避光染色；2)加入染色缓冲液，离心；3)加入染色缓冲液重悬细胞，于流式细胞仪中进行检测。2.根据权利要求1所述的一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法，其特征在于，所述染色缓冲液为加入1％体积胎牛血清的磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的一种筛选参与脂质缓冲的巨噬细胞亚群的方法，其特征在于，所述步骤1)或3)染色缓冲液为200μL；所述步骤2)染色缓冲液为1mL，400g离心5min。4.根据权利要求1所述的一种筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕艳，袁月，王洪东，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：