本发明专利技术提供了大叶金腰SSR分子标记引物组合，所述引物组合包括：扩增cpSSR2的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.1～2所示；扩增cpSSR5的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.3～4所示；扩增cpSSR11的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.5～6所示；扩增cpSSR12的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.7～8所示；扩增cpSSR23的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.9～10所示。本发明专利技术提供的大叶金腰SSR分子标记引物组合能够对大叶金腰遗传多样性进行分析，为大叶金腰不同居群材料鉴定、遗传进化分析提供可靠的标记资源。记资源。记资源。
【技术实现步骤摘要】
一种大叶金腰SSR分子标记引物组合及应用
[0001]本专利技术属于植物生物
，具体涉及大叶金腰叶绿体基因组SSR分子标记开发及应用。
技术介绍
[0002]金腰属Chrysosplenium L.是虎耳草科多年生小草本，全属约70种，该属植物药效显著，长期以来被用于治疗各类疾病。其中大叶金腰(Chrysosplenium macrophyllun Oliv.)(虎皮草；马耳朵草；龙香草)为中国特有种，分布于湖北、湖南、江西、贵州、安徽、浙江、四川、云南、广东、广西、陕西、福建省，重庆市等。它是民间常用的中草药，具有清热解毒，生肌收敛作用，全株入药，味苦、涩、性寒，可用于治疗小儿惊风、肺和耳部疾病等。
[0003]SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)由1～6个核苷酸组成的串联重复单元组成，广泛存在于真核生物的核基因组、叶绿体和线粒体基因组。因其具有数量丰富、多态性高、共显性、重复性好、操作简单等特点，已被广泛应用于种质资源与品种鉴定和遗传多样性分析。叶绿体基因组为单性遗传、几乎不发生基因重组、相对于核基因组更加保守。因此，基于叶绿体基因组信息开发的SSR标记，可以用于更高分类阶元的系统发育研究、种间及种内鉴定和遗传图谱及DNA指纹图谱的构建。目前，大量叶绿体基因组信息已被测序，叶绿体SSR标记被开发应用。沙秀芬等利用10对cpSSR引物和 13对mtSSR引物分析了61丹参遗传多样性，并验证了引物在鼠尾草属植物种间的通用性。李思巧等利用开发的2对cpSSR引物可以将花椒、竹叶花椒和日本花椒进行区分。张静珍等采用叶绿体SSR标记，对64份山药种质资源进行遗传多样性分析，并使用2 对cpSSR引物成功构建了山药的DNA指纹图谱。娄文睿等初步开发了山核桃属cpSSR 标记，并筛选到了6对多态性引物，可用于山核桃属不同物种间的区分。
[0004]目前，关于大叶金腰的研究报道非常少，黄稳等采用SRAP标记技术对金腰属，包括大叶金腰在内的24个物种36份材料进行遗传多态性和聚类分析，并构建了38份金腰的DNA指纹图谱。而关于大叶金腰的相关分析还未见报道。
技术实现思路
[0005]为了弥补本领域中大叶金腰SSR分子标记的空缺，本专利技术基于大叶金腰叶绿体基因组开发了cpSSR分子标记，并筛选出五组多态性cpSSR分子标记引物，上述大叶金腰 SSR分子标记引物组合能够对大叶金腰遗传多样性进行分析，为大叶金腰不同居群材料鉴定、遗传进化分析提供可靠的标记资源。
[0006]实现本专利技术上述目的所采用的技术方案为：
[0007]一种大叶金腰SSR分子标记引物组合，所述SSR分子标记包括cpSSR2、cpSSR5、 cpSSR11、cpSSR12、cpSSR23五组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～15所示；
[0008]所述引物组合包括：
[0009]扩增分子标记cpSSR2的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.1～2所示；
[0010]扩增分子标记cpSSR5的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.3～4所示；
[0011]扩增分子标记cpSSR11的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.5～6所示；
[0012]扩增分子标记cpSSR12的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.7～8所示；
[0013]扩增分子标记cpSSR23的引物，正向及反向引物如SEQ ID NO.9～10所示。
[0014]所述大叶金腰SSR分子标记引物组合能够应用于大叶金腰种群遗传多样性分析中，具体步骤如下：
[0015](1)基因组DNA提取：采用改良CTAB法提取大叶金腰高质量总基因组DNA， DNA质量和浓度采用紫外分光光度核酸测定仪测定，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测确认；
[0016](2)PCR反应体系：对应配制五组，每一组反应体系总体积为10μL，包含2
×
T5 Super PCR Mix(PAGE)5μL、10μmol
·
L
‑1正反向引物各0.4μL，总基因组DNA1μL， ddH2O 3.2μL；
[0017]PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃总延伸2min后4℃保存；
[0018](3)电泳检测：采用4％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳缓冲液为 1
×
TBE，90W恒压电泳1.5～2.0h，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；
[0019](4)数据分析：根据电泳图像，采用人工读带的方法，将图上可重复的、易分辨的条带记为“1”，同一位置无带计为“0”，并将数据输入Excel建立原始“01”数据矩阵；
[0020]利用NTSYS软件计算遗传相似系数，并采用非加权配对算术平均法UPGMA进行遗传相似性聚类分析；
[0021]运用GENDIVE version3.06软件，计算等位基因数Na、有效等位基因数Ne、观测杂合度Ho和期望杂合度He等多样性指标。
[0022]所述大叶金腰SSR分子标记引物组合的获取方法，获取方法包括以下步骤：
[0023](1)大叶金腰叶绿体基因组序列获取及cpSSR位点鉴别
[0024]从GenBank公共数据库中下载大叶金腰叶绿体基因组序列MK973001，利用MISA perl脚本软件搜索叶绿体基因组中分布的SSR位点，获得初筛cpSSR分子标记的核苷酸序列；检索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重复次数分别设置10、6、5、5、5和5次；
[0025](2)cpSSR引物设计
[0026]利用Primer 3软件对上步骤中初筛cpSSR分子标记的核苷酸序列进行引物设计，引物设计原则为：GC含量40～60％，退火温度57～60℃，引物长度18～23bp，预计扩增产物长度100～300bp；获得初筛cpSSR引物的核苷酸序列；
[0027](3)cpSSR引物二次筛选
[0028]先采用改良CTAB法提取大叶金腰高质量总基因组DNA，然后以此为模板，对上步骤中的初筛cpSSR引物均构建PCR反应体系，进行PCR反应，PCR扩增结束后，采用凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；选取其中稳定性好、多态性高、清晰度高的电泳条带所对应的引物，即得到所述的大叶金腰 SSR分子标记引物组合。
[0029]由于采用上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：
[0030](1)本专利技术利用大叶金腰叶绿体基因组序列开发的SSR标记，填补了大叶金腰SSR 分子标记的空缺。
[0031](2)本专利技术利用开发的cpSSR多态性标记引物分析评价了大叶金腰群体间的多态性。
[0032](3)本专利技术为后续学者筛选更多的大叶金腰SSR位点提供了思路。为开展本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种大叶金腰SSR分子标记引物组合，其特征在于：所述SSR分子标记包括cpSSR2、cpSSR5、cpSSR11、cpSSR12、cpSSR23五组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～15所示；所述引物组合包括：扩增分子标记cpSSR2的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；扩增分子标记cpSSR5的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；扩增分子标记cpSSR11的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示；扩增分子标记cpSSR12的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示；扩增分子标记cpSSR23的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示。2.权利要求1中所述大叶金腰SSR分子标记引物组合在大叶金腰种群遗传多样性分析中的应用。3.根据权利要求2所述的大叶金腰SSR分子标记引物组合在大叶金腰种群遗传多样性分析中的应用，其特征在于：具体步骤如下：(1)基因组DNA提取：采用改良CTAB法提取大叶金腰高质量总基因组DNA，DNA质量和浓度采用紫外分光光度核酸测定仪测定，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测确认；(2)PCR反应体系：对应配制五组，每一组反应体系总体积为10μL，包含2
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T5 Super PCR Mix(PAGE)5μL、10μmol
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‑1正反向引物各0.4μL，总基因组DNA 1μL，ddH2O 3.2μL；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃总延伸2min后4℃保存；(3)电泳检测：采用4％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳缓冲液为1
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘娇，刘虹，覃瑞，向妮艳，赛米热，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：
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