一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多个水稻矮杆基因的高效应变异检测液相芯片及其应用，包括如下步骤：选择目标变异，PCR引物设计及筛选和功能标记基因型鉴定。利用本发明专利技术开发出来的矮杆基因检测芯片RDWFMP1，可以对50个水稻株高控制基因的90个高效应变异位点进行准确的基因型鉴定。可以很方便地对大量育种材料进行多个矮杆基因变异扫描。有效地克服了传统分子标记技术的低效率的问题，同时检测成本比基于常规的二代测序及高密度芯片的检测方法大大降低。该发明专利技术在新矮杆等位基因的挖掘及分子标记辅助育种方面有重要应用价值。种方面有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用


[0001]本专利技术涉及水稻重要农艺性状控制基因变异检测
，尤其涉及一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用。

技术介绍

[0002]我国是世界上最大的稻米生产国和消费国。水稻的安全生产是国家粮食安全及农业可持续发展的关键保障。株高是决定水稻产量潜力的重要农艺性状。矮杆可以增强水稻品种的抗倒伏性增加收获指数，是高产稳产的关键。所以矮杆是一个最重要的育种选择指标。对矮杆品种的选择一般通过田间肉眼确定或者测量株高的方法进行选择，选择的过程中可能会选择到含有杂合位点的矮杆基因，下一代会进一步产生性状分离，选择的过程比较长。利用分子标记技术(Molecularmarker technologies)进行分子标记辅助选择是提高选择效率的必然选择。常规的分子标记方法存在，检测过程复杂，不适合等缺点。目前，高通量分子标记技术平台主要包括：第二代测序技术、基因芯片技术。但常规的二代测序技术，存在单个样本检测成本高，数据分析复杂等缺点。基因芯片检测，也存在制备芯片成本及检测成本高的缺点，更适合于对少量材料进行高密度SNP检测的应用场景。另外一个问题是可以利用的矮杆基因的分子标记还比较少，所以无法针对性的开展矮杆性状的分子标记辅助育种及设计育种。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0005]一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用，其特征在于，包括如下步骤：
[0006]S1、选择目标变异，利用株高不同的育种材料的高通量测序数据进行株高相关基因的变异分析，获得有较强效应的SNP位点，具体指发生在基因编码区的变异，优先选择能产生氨基酸的变异，或导致编码蛋白提前终止的变异或发生在剪切位点的变异。本专利技术选择的目标位点及变异分布信息见表1；
[0007]S2、PCR引物设计及筛选，根据变异位点在水稻参考基因组中的位置，提取变异位点上下游200bp的序列，进行引物设计，在设计出的引物中进一步进行如下评估选择：针对设计出来的引物进行非特异性评估，然后挑出非特异性的引物；引物之间进行二聚体评估，避免二聚体的产生；针对上述两步筛选的引物，再次进行两两非特异性评估；选出终符合要求的引物，符合要求的引物等量混合构成用于检测多个水稻矮杆基因变异的功能标记芯片，该芯片命名为RDWFMP1；
[0008]S3、功能标记基因型鉴定。
[0009]优选的，所述S2中引物设计选择引物长度18
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36bp；TM值59
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64℃；GC 含量15％
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70％的引物。
[0010]优选的，所述S3中功能标记基因型鉴定，包括如下步骤：
[0011]S31、DNA提取及基因组定量，用CTAB方法进行DNA提取，提取后利用试剂盒或荧光定量PCR方法对基因组进行精确定量。
[0012]S32、靶区域扩增，利用0.2ml PCR管/96孔PCR板进行PCR扩增，反应体系如下：RDWFMP18μl，模板DNA(≥50ng)，GenoPlexs 3
×
T Master Mix 10μ l，用超纯水补齐30μl。
[0013]S33、PCR产物纯化，利用GenoPrep DNA Clean Beads纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。
[0014]S34、第二轮PCR及PCR产物回收，对回收产物进行PCR扩增，引入与测序相应接头与barcode，在所得带有磁珠的Tube管中加入PCR体系，其扩增体系为I5 Barcode(10uM)
‑
MGI 1μl，I7 Barcode(2uM)
‑
MGI 5μl，GenoPlexs 3
×ꢀ
T Master Mix 10μl，超纯水14μl，PCR扩增步骤包括：95℃ 3min热启动； 95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，7次循环，72℃延伸4min，利用GenoPrep DNAClean Beads纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，对纯化产物进行DNA浓度测定，产物可直接用于上机测序或置于
‑
20℃保存。
[0015]S35、高通量测序及数据分析，对得到的纯化后的PCR产物进行高通量测序和数据分析，获得靶区域的基因型鉴定结果。
[0016]优选的，所述S32中PCR扩增包括如下步骤：
[0017]S321、95℃，3min热启动；95℃ 30s，60℃ 4min，进行15次循环，
[0018]S321、72℃延伸4min。
[0019]优选的，所述S33中PCR产物纯化包括如下步骤：
[0020]S331、向PCR反应液/酶促反应液加入0.4倍体积GenoPrep DNA CleanBeads(30μl体系加12μl)，涡旋震荡，使扩增产物与GenoPrep DNA CleanBeads充分混匀，室温静置5
‑
6分钟后瞬离。
[0021]S332、用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，室温静置2min此时溶液为澄清。
[0022]S333、用移液器小心吸取全部上清至新的EP管子/96孔板中(保留上清)，小心避免吸到磁珠。该步骤被吸附的磁珠可抛弃。
[0023]S334、向新的上清液中加入0.6倍原始PCR体积GenoPrep DNA CleanBeads(30μl体系加18μl)，涡旋震荡，使扩增产物与GenoPrep DNA CleanBeads充分混匀。室温静置5
‑
6分钟后瞬离。
[0024]S335、用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，室温静置2min此时溶液为澄清。用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠。
[0025]S336、加入等PCR体积的GenoPlexs BW10 Buffer，涡旋震荡，重悬磁珠，室温静置5
‑
6分钟后瞬离。用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器吸取上清，弃上清，留磁珠。
[0026]S337、保持PCR管处于磁力架中，加入80
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100μl 80％的乙醇，室温静置 1
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1.21min此时溶液为澄清。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。
[0027]S338、室温放置，直至乙醇挥发干净。
[0028]优选的，表1中的所列基因及变异位点为检测的靶标位点。
[0029]优选的，对表1中的所列的多个变异位点同时进行基因型鉴定。
[0030]优选的，对表1中SNP位点，选择其侧翼200bp进行引物设计和PCR扩增，所以表1中所列SNP位点，上下游200bp的范围内的SNP/InDel均可被本专利技术的方法有效覆盖，以这些变异位点为目标的检测也在本专利技术的权利要求范围内。
[0031]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用，其特征在于，包括如下步骤：S1、选择目标变异，利用不同株高的育种材料的高通量测序数据进行株高相关基因的变异效应分析，获得有较强效应的SNP位点，即发生在基因编码区的变异，优先选择能产生氨基酸的变异，或导致编码蛋白提前终止的变异或发生在剪切位点的变异，本发明选择的目标位点及变异分布信息见表1；S2、PCR引物设计及筛选，根据变异位点在水稻参考基因组中的位置，提取变异位点上下游200bp的序列，进行引物设计，在设计出的引物中进一步进行如下评估选择：针对设计出来的引物进行非特异性评估，然后挑出非特异性的引物；引物之间进行二聚体评估，避免二聚体的产生；针对上述两步筛选的引物，再次进行两两非特异性评估；选出终符合要求的引物，符合要求的引物等量混合构成用于检测多个水稻矮杆基因变异的功能标记芯片，该芯片命名为RDWFMP1；S3、功能标记基因型鉴定。2.根据权利要求1所述的一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用，其特征在于：所述S2中引物设计选择引物长度18
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36bp；TM值59
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64℃；GC含量15％
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70％的引物。3.根据权利要求1所述的一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用，其特征在于：所述S3中功能标记基因型鉴定，包括如下步骤：S31、DNA提取及基因组定量，用CTAB方法进行DNA提取，提取后利用试剂盒或荧光定量PCR方法对基因组进行精确定量。S32、靶区域扩增，利用0.2ml PCR管/96孔PCR板进行PCR扩增，反应体系如下：RDWFMP1 8μl，模板DNA(≥50ng)，GenoPlexs 3
×
T Master Mix 10μl，用超纯水补齐30μl。S33、PCR产物纯化，利用GenoPrep DNA Clean Beads纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。S34、第二轮PCR及PCR产物回收，对回收产物进行PCR扩增，引入与测序相应接头与barcode，在所得带有磁珠的Tube管中加入PCR体系，其扩增体系为I5 Barcode(10uM)
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MGI 1μl，I7 Barcode(2uM)
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MGI 5μl，GenoPlexs 3
×
T Master Mix 10μl，超纯水14μl，PCR扩增步骤包括：95℃ 3min热启动；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，7次循环，72℃延伸4min，利用GenoPrep DNA Clean Beads纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，对纯化产物进行DNA浓度测定，产物可直接用...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫双勇，郭彦丽，李军玲，崔中秋，路信，汪颖，刘学军，王胜军，苏京平，孙林静，孙玥，张融雪，刘静妍，王晓静，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：