一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。用于检测南洋杉异担子菌的引物组合物是由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和环引物LF组成。本发明专利技术根据南洋杉异担子菌的RNA聚合酶II第二大亚基RPB2序列设计引物，反应程序为：63℃等温条件扩增60min，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到待检样品中存在的南洋杉异担子菌，不需要复杂仪器，能较好满足对南洋杉异担子菌的现场检测，适用于出入境植物和植物的检验检疫和病害的调查、快速诊断及监测等，对防止南洋杉异担子菌传入我国具有重要意义，同时，本发明专利技术体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。理论依据。理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物及其应用。

技术介绍

[0002]南洋杉异担子菌(Heterobasidion araucariae)属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲 (Agaricomycetes)，红菇目(Russulales)，刺孢多孔菌科(Bondarzewiaceae)，异担子菌属(Heterobasidion)。异担子菌属中许多种是引起针叶树干基腐朽病的病原菌，引起的病害对许多针叶树造成树木干基白色腐朽病害，直接造成森林的大面积死亡。
[0003]目前，针对南洋杉异担子菌的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法，依据南洋杉异担子菌的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的菌物鉴定经验，而且很难依据形态学特征将南洋杉异担子菌与相近种区分开，无法满足林间生产上的需求。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到南洋杉异担子菌的检测中。但是这些检测技术往往需要在具有专业仪器、试剂和严格环境条件的实验室中进行，仪器和试剂的价格昂贵且操作要求较高，过程复杂，检测时间仍然较长，不能满足快速检测的需求，不适宜在基层环境中使用推广。
[0004]环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是近些年开发的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通 PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生。在反应体系中加入SYBR Green、羟基萘酚蓝(HNB) 等显色染料，可通过肉眼观察颜色变化来判定。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。目前此技术已广泛应用于真菌、细菌、病毒和卵菌的快速检测，但在南洋杉异担子菌的检测国内外均未见报道。
[0005]戴玉成等曾报道了RNA聚合酶II大亚基序列(RPB1)分子标记在异担子菌种类中敏感性最高，是通过基因手段鉴别不同异担子菌种类的可信片段，并以此为靶标设计引物用于异担子菌的分子鉴定。然而在实际应用中，异担子菌的RPB1序列的扩增反应常常不易成功，致使无法成功且快速进行分子鉴定。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有技术中南洋杉异担子菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测南洋杉异担子菌的问题，而提供了一种快速检测南洋杉异担子菌的LAMP检测引物组合物及其分子检
测方法，此方法检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。
[0007]本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
[0008]用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物，由如SEQ ID N0.1所示的正向内引物FIP，如SEQ ID N0.2所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.3所示的正向外引物F3，如SEQ ID N0.4 所示的反向外引物B3，如SEQ ID N0.5所示的正向环引物LF(图1)。
[0009]本专利技术所述的引物组合物在检测南洋杉异担子菌中的应用。
[0010]本专利技术所述的引物组合物在制备南洋杉异担子菌的LAMP检测试剂盒中的应用。
[0011]一种检测南洋杉异担子菌的LAMP试剂盒，含有本专利技术所述的引物组合物。
[0012]所述的检测南洋杉异担子菌的LAMP试剂盒，还包含以下组分：10
×
ThermoPol Buffer， MgS04，dNTPs，甜菜碱，Bst DNA polymerase，羟基萘酚蓝。
[0013]本专利技术所述试剂盒在检测南洋杉异担子菌的应用。
[0014]一种南洋杉异担子菌的LAMP检测方法，其特征在于提取待检微生物DNA，取DNA溶液作为反应模板，加入所述LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若呈天蓝色表示检测结果为阳性，存在南洋杉异担子菌，若呈紫色表示检测结果为阴性，不存在南洋杉异担子菌。
[0015]作为本专利技术的一种优选，所述的LAMP反应体系：2.5μL10
×
ThermoPol Buffer， 8mmol
·
L
‑1MgS04，1.2mmol
·
L
‑1dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6μmol
·
L
‑1，外引物F3和B3各 0.4μmol
·
L
‑1，0.8μmol
·
L
‑1环引物LF，0.8μmol
·
L
‑1甜菜碱，8U
·
μL
‑1Bst DNA polymerase，180mmol
·
L
‑1羟基萘酚蓝，2μL模板DNA，灭菌水补至26μL。
[0016]作为本专利技术的一种优选，所述LAMP反应的程序为：63℃反应扩增60min。
[0017]本专利技术的检测南洋杉异担子菌的方法，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP反应；Hydroxylnaphthol blue(HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg
2+
的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg
2+
浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg
2+
与LAMP反应的副产物结合产生大量沉淀，溶液中Mg
2+
浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断南洋杉异担子菌的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在南洋杉异担子菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在南洋杉异担子菌。
[0018]本专利技术与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
[0019]本专利技术选用的RNA聚合酶II第二大亚基(RPB2)包含多个内含子，非编码区具有足够的特异性位点，并且其序列在种内高度保守，容易扩增成功，非常适合作为异担子菌的分子检测靶标。本专利技术以RPB2基因为检测的靶标序列，设计了南洋杉异担子菌的特异性的LAMP 引物组合物，在此基础上设计了LAMP引物组合物，建立了南洋杉异担子菌的LAMP快速检测方法，具有特异性强、准确度高、灵敏度好的优点。
[0020](1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物，其特征在于，该引物组合物由以下引物组成:如SEQ ID No.1所示的正向内引物FIP，如SEQ ID No.2所示的反向内引物BIP，如SEQ ID No.3所示的正向外引物F3，如SEQ ID No.4所示的反向外引物B3，如SEQ ID No.5所示的正向环引物LF。2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测南洋杉异担子菌中的应用，所述的检测为非疾病诊断目的的检测。3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备用于检测南洋杉异担子菌的试剂盒中的应用。4.一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1所述的LAMP引物组合物。5.根据权利要求4所述的用于检测南洋杉异担子菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含10
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ThermoPol Buffer、MgS04、dNTPs、甜菜碱，Bst DNA polymerase、羟基萘酚蓝。6.权利要求4或5所述的LAMP试剂盒在检测南洋杉异担子菌中的应用，所述的检测为非疾病诊断目的的检测。7.一种南洋杉异担子菌的LAMP检测方法，其特征在于提取待检微生物DNA，取DNA溶液作为反应模板，以权利要求1所述的引物组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳佳，戴玉成，员瑗，刘晓宇，于健，吴慕桥，周洪敏，吴翠萍，
申请(专利权)人：北京林业大学南京海关动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：