牡丹枝孢霉的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用技术

本发明专利技术属于油用牡丹红斑病检测诊断技术领域，具体涉及牡丹红斑病的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用。将筛选出针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物直接用于建立的LAMP反应体系中并扩增目标DNA，通过目标DNA的凝胶电泳条带进行红斑病菌的特异性检测和LAMP颜色反应的特异性检测诊断出牡丹红斑病。本发明专利技术建立的LAMP检测体系，对于发病早期无明显病征以及中后期有明显病征的病叶，均能灵敏地实现对红斑病的诊断。对红斑病的诊断。对红斑病的诊断。

【技术实现步骤摘要】
牡丹枝孢霉的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用


[0001]本专利技术属于油用牡丹红斑病检测诊断
，具体涉及牡丹红斑病菌的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用。

技术介绍

[0002]类似于人生病时去医院看病，医生需要通过各项指标来判断病因及疾病种类。植物病害诊断也是需要通过各种方法，鉴定病原物的种类，进而对植物病害做出诊断，并建议生产中的施药选择。而除了白粉病、锈病、霜霉病、黑粉病等病征和病状典型的病害，依据发病部位的病状和病征可以直接作出判断；对于大部分病害，尤其是叶斑类病害，病征很少，即使有病征，也往往仅有菌丝而无孢子，依据发病部位形成的病征很难作出准确判断。往往需要将病菌从发病部位进行分离，依据分离出的病菌在培养基上产生的菌落、形成的孢子及产孢结构等，作出准确判断；而某些病菌如果不产孢，则需培养后提取DNA，进行DNA特异性片段特异性扩增后测序，依据序列结果进行BLAST序列比对，确认病菌归宿。
[0003]随着分子生物学技术的进步，尤其是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的普及，人们尝试采用普通PCR技术来对植物病害进行快速诊断。操作步骤如下：从发病组织中提取DNA，然后依据疑似的病原菌的保守序列设计引物，进行PCR扩增反应；扩增出条带后，送至生物公司测序；将所获得的序列在NCBI网站上比对，依据得分高低判断病菌归属。
[0004]相比于传统的病菌形态特征诊断结合病菌的分离，借助于普通PCR的植物病害的分子诊断具有测定结果准确、不受病菌是否产孢等因素影响。但该技术需要昂贵的PCR仪；且由于需要进行病原菌基因组保守序列搜索、比对等，对操作人员要求较高，在生产中推广应用难度较大。
[0005]牡丹不仅因其花大而香、花色艳丽而具有极高的观赏价值，而且根部含有抗菌消炎物质——丹皮酚，籽粒中含有42%以上的α
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亚麻酸、92%以上的不饱和脂肪酸等数十种营养成分，使牡丹同时具有很高的药用和食用价值。
[0006]由牡丹红斑病菌引起的红斑病是牡丹上发病最严重的病害之一，发病严重时可导致牡丹叶片干枯变黄，植株生长势变弱、产籽量减少，花色衰退等，对切花牡丹、观赏牡丹以及油用牡丹的产业化发展带来巨大的威胁，造成严重的经济损失。牡丹红斑病主要危害茎和叶片，也能侵染叶柄、嫩叶和枝。一般下部叶片最先感病，叶片发病初期叶正、背面出现绿色针头状小点，以后扩展为直径 3～12mm 的紫褐色近圆形的病斑，中央淡黄褐色，边缘暗紫褐色，30d 后可扩展成10～30mm大小的病斑，有的病斑相连成片，大多数病斑有明显的同心轮纹，在病斑上呈现不整齐淡褐色轮状环纹和霉状物。在潮湿的气候条件下，病斑背面常生墨绿色或灰褐色霉层，似绒毛状，为病菌的菌丝和分生孢子梗。当病害侵染茎时，茎上出现紫褐色长圆形的病斑小点，稍隆起，病斑扩展缓慢，后期病斑长径仅为 3～5mm；病斑中间开裂并下陷，严重时病斑相连成片，潮湿时病部也产生霉层，常导致嫩枝枯死。叶柄、叶脉感病后，症状与茎相同。萼片与花瓣上病斑开始均为褐色小点，严重时边缘枯焦。
[0007]牡丹红斑病与多种牡丹病害常常混合发生，且发病初期症状不明显，不易区分，故无法及时采取措施来控制病害的发生。因此建立一种能够在红斑病发病初期诊断检测病害的方法，对于红斑病的早期监测与防控具有重要意义。
[0008]传统的形态学鉴定法是根据发病症状和病原菌的形态学观察来判断和鉴定真菌，是目前最常用的真菌分类和鉴定方法，同时也是真菌分类学研究的基础。主要通过病原菌在某些特定或专性培养基上的生长速度、菌落颜色、菌落形状和大小、气生菌丝茂盛程度、有无特殊气味等特征，以及通过显微镜观察，记录其孢子形状和大小、产孢结构、菌丝缠绕等特征，并与相关资料进行比较来鉴定病原菌。此外，普通PCR技术是指利用DNA聚合酶，在体外进行特异性的DNA序列的扩增反应，广泛应用于病原菌鉴定以及病害早期诊断等方面。但该方法需要有一定专业知识储备的人员才能使用，且费时费力，对结果的判断存在误差，准确性较差。由于一些牡丹病害的病原菌种类不明确，判断标准不统一，基层工作人员以及牡丹种植户在实际应用中利用该方法存在诸多困难。

技术实现思路

[0009]为解决上述问题，本专利技术提供牡丹红斑病菌的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用，实现牡丹红斑病的全发病期检测，即无论是在发病早期，还是在发病中期和后期，均能灵敏地实现对红斑病的诊断。
[0010]本专利技术通过以下技术方案来实现：一种牡丹红斑病菌的检测方法，具体步骤如下：步骤一、筛选出针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物，所述LAMP特异性引物包括内引物FIP/BIP和外引物F3/B3；步骤二、建立LAMP反应体系并扩增目标DNA，具体方法为：将2.5 μL 10
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ThermoPol Buffer、0.16 U/μL Bst DNA聚合酶、1 mmol/L dNTP、8 mmol/L MgSO4、0.2 μmol/L F3/B3、0.6 mol/L 甜菜碱、1.6 μmol/L FIP/BIP、0.15 mmol/L HNB、1 μL模板DNA，ddH2O补至25 μL混匀后放入水浴锅中反应，反应温度为60
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68 ℃，反应时间为57
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63 min；步骤三、将步骤二中的扩增目标DNA进行红斑病菌的特异性检测以诊断出牡丹红斑病。
[0011]进一步优化，所述步骤一中LAMP特异性引物的筛选方法：利用MEGA软件对牡丹红斑病菌的ITS基因序列以及牡丹黑斑病菌、腔孢叶斑病菌、黄斑病菌、灰霉病菌的ITS基因序列进行比对分析，从中筛选出红斑病菌与其他病菌序列同源性低的片段，并将获得的基因片段在在线软件上设计针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物。
[0012]进一步优化，所述步骤二中扩增结束后通过观察PCR管的颜色变化以及2%琼脂糖凝胶电泳结果来判断扩增反应是否进行。
[0013]进一步优化，所述步骤二中模板DNA为牡丹红斑病、牡丹黄斑病、牡丹灰霉病、牡丹黑斑病的总DNA。
[0014]进一步优化，所述步骤三中的LAMP反应的特异性检测的方法为：设置阴性对照，在LAMP反应体系中加入与其他处理组模板等量的ddH2O代替，将LAMP反应体系进行LAMP反应的特异性检测。
[0015]一种牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病诊断的应用，通过所述牡丹红斑
病菌的检测方法在油用牡丹红斑病早期和中后期的诊断。
[0016]进一步优化，所述油用牡丹红斑病早期诊断检测：采集类似牡丹红斑病的发病叶片，将发病部位剪下，60
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70℃恒温水浴9
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11min后，10000rpm离心8
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12min，取上清液作为LAMP反应的模板DNA，以添加等量ddH2O的处理作为阴性对照，同时以红斑病菌基因组DNA为阳性对照，进行发病叶片的LAMP检测，LAMP反应结束后，结合离心管颜色反应及凝胶电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一、筛选出针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物，所述LAMP特异性引物包括内引物FIP/BIP和外引物F3/B3；步骤二、建立LAMP反应体系并扩增目标DNA，具体方法为：将2.5 μL 10
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ThermoPol Buffer、0.16 U/μL Bst DNA聚合酶、1 mmol/L dNTP、8 mmol/L MgSO4、0.2 μmol/L F3/B3、0.6 mol/L 甜菜碱、1.6 μmol/L FIP/BIP、0.15 mmol/L HNB、1 μL模板DNA，ddH2O补至25 μL混匀后放入水浴锅中反应，反应温度为60
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68 ℃，反应时间为57
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63 min；步骤三、将步骤二中的扩增目标DNA进行红斑病菌的特异性检测以诊断出牡丹红斑病。2.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，所述步骤一中LAMP特异性引物的筛选方法：利用MEGA软件对牡丹红斑病菌的ITS基因序列以及牡丹黑斑病菌、腔孢叶斑病菌、黄斑病菌、灰霉病菌的ITS基因序列进行比对分析，从中筛选出红斑病菌与其他病菌序列同源性低的片段，并将获得的基因片段在在线软件上设计针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物。3.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，所述步骤二中扩增结束后通过观察PCR管的颜色变化以及2%琼脂糖凝胶电泳结果来判断扩增反应是否进行。4.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，所述步骤二中模板DNA为牡丹红斑病、牡丹黄斑病、牡丹灰霉病、牡丹黑斑病的总DNA。5.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建强，侯小改，姜佳，柴秋源，罗诗瑶，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：