CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及体外扩增NK细胞的方法领域，尤其涉及CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法。本发明专利技术将外周血单个核细胞接种到预包被的RetroNectin和鼠抗人CD16细胞培养瓶中，并添加含IL

【技术实现步骤摘要】
CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及体外扩增NK细胞的方法领域，尤其涉及CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]现有的体外扩增NK细胞技术中，细胞培养方法采用赫赛汀、Herceptin和PHA、RetroNectin+美罗华抗体+鼠抗人CD161抗体包板、透明质酸+CD16+
[0003]RetroNectin等等，还有经典的采用滋养细胞的方法。上述方法在操作过程中容易引入安全性问题(例如多种外源因子或试剂的引入均可能增加细胞质量控制的难度，进而增加临床应用的风险)，且存在操作复杂，导致工艺不稳定及成本较高的问题。

技术实现思路

[0004]针对
技术介绍
中存在的问题，提出CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法。本专利技术将外周血单个核细胞接种到预包被的RetroNectin和鼠抗人CD16细胞培养瓶中，并添加含IL
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2、IL
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15、IL
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21和自体血浆的培养基。不使用磁珠分选细胞，也不使用滋养层细胞活化方法，操作简单，成效快，制备成本低，安全性高。可高效扩增NK细胞，14天内细胞扩增148倍。
[0005]本专利技术提出CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，方法步骤包括：
[0006]S1、从外周血中分离出单个核细胞；
[0007]S2、将外周血单个核细胞接种到预包被的RetroNectin和鼠抗人CD16细胞培养瓶中，并添加含IL
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2、IL
‑
15、IL
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21和自体血浆的培养基；
[0008]S3、连续培养14
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17天，获得高纯度高活性NK细胞。
[0009]优选的，培养前需要先制备包被液。
[0010]优选的，包被液的组成成分包括10mlPBS、35ug Retronectin和35ug CD16，混合制备。
[0011]优选的，具体步骤包括：
[0012]A、包被：将包被液加入培养瓶，铺匀平放，在4℃条件下，避光过夜；
[0013]B、采血：采集外周血15ml,将其加入离心管一中备用；
[0014]C、淋巴细胞分离液分离：向离心管中加入等体积PBS至30ml，混匀后转移至提前添加15ml淋巴分离液的离心管二，在1800rpm/800g，室温条件下离心20min，升降速设为0；
[0015]D、洗涤PBMC：用吸管将离心后中间白色的PBMC层吸出，在离心管三中加入18
‑
22ml的PBS清洗，在2000rpm条件下离心6min，弃上清；再次用20mlPBS清洗，在1800rpm条件下离心6min，弃上清；使用培养基重悬、混匀、取样，采用typan blue染色计数，1800rpm条件下离心6min，弃上清；
[0016]E、配制细胞悬液：用40ml培养基重悬细胞、沉淀、混匀；
[0017]F、接种细胞：取40ml上述的细胞悬液加入培养瓶，添加终浓度30ng/ml的IL
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15、终
浓度100ng/ml的IL
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21、终浓度5％的自体血浆、终浓度6000U/ml的IL
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2，将接种后的培养瓶置二氧化碳培养箱培养；
[0018]G、培养至4、6、8、11和14天时分瓶培养，期间检测，并在第17日回收细胞。
[0019]优选的，二氧化碳培养箱的培养条件：温度为37℃，CO2浓度为5％。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益的技术效果：
[0021]本专利技术将外周血单个核细胞接种到RetroNectin和鼠抗人CD16预包被的细胞培养瓶中，并添加含IL
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2、IL
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15、IL
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21和自体血浆的培养基。其中抗CD16抗体通过结合NK细胞表位的CD16位点，增强IL
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15和IL
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2对NK细胞的刺激，以及ADCC对肿瘤细胞的杀伤作用，进而诱导NK细胞活化，获得扩增的效率和纯度更高的NK细胞。上述技术不使用磁珠分选细胞，也不使用滋养层细胞活化方法，操作简单，成效快，制备成本低，安全性高。可高效扩增NK细胞，14天内细胞扩增148倍。NK细胞纯度高，具有很高的临床价值。
附图说明
[0022]图1为本专利技术一种实施例中方法流程示意图；
[0023]图2为14天内NK细胞扩增示意图；
[0024]图3为流式检测NK细胞的结果示意图。
具体实施方式
[0025]实施例一
[0026]本专利技术提出的CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，方法步骤包括：
[0027]S1、从外周血中分离出单个核细胞；
[0028]S2、将外周血单个核细胞接种到预包被的RetroNectin和鼠抗人CD16细胞培养瓶中，并添加含IL
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2、IL
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15、IL
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21和自体血浆的培养基；
[0029]S3、连续培养14
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17天，获得高纯度高活性NK细胞。
[0030]实施例二
[0031]本专利技术提出的CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，方法步骤包括：
[0032]S1、从外周血中分离出单个核细胞；
[0033]S2、将外周血单个核细胞接种到预包被的RetroNectin和鼠抗人CD16细胞培养瓶中，并添加含IL
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2、IL
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15、IL
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21和自体血浆的培养基；
[0034]S3、连续培养14
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17天，获得高纯度高活性NK细胞。
[0035]进一步的，培养前需要先制备包被液。
[0036]进一步的，包被液的组成成分包括10mlPBS、35ug Retronectin和35ug CD16，混合制备。
[0037]实施例三
[0038]如图1所示，本专利技术提出的CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，方法步骤包括：
[0039]A、包被：将包被液加入T75培养瓶，铺匀平放，在4℃条件下，避光过夜；
[0040]B、采血：采集外周血15ml,将其加入50ml的离心管一中备用；
[0041]C、淋巴细胞分离液分离：向离心管中加入等体积PBS至30ml，混匀后转移至提前添加15ml淋巴分离液的离心管二，在1800rpm/800g，室温条件下离心20min，升降速设为0；
[0042]D、洗涤PBMC：用巴斯德吸管将离心后中间白色的PBMC层吸出，在离心管三中加入18
‑
22ml的PBS清洗，在2000rpm条件下离心6min，弃上清；再次用20mlPBS清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，其特征在于，方法步骤包括：S1、从外周血中分离出单个核细胞；S2、将外周血单个核细胞接种到预包被的RetroNectin和鼠抗人CD16细胞培养瓶中，并添加含IL
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2、IL
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15、IL
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21和自体血浆的培养基；S3、连续培养14
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17天，获得高纯度高活性NK细胞。2.根据权利要求1所述的CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，其特征在于，培养前需要先制备包被液。3.根据权利要求1所述的CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，其特征在于，包被液的组成成分包括10mlPBS、35ugRetronectin和35ug CD16抗体，混合制备。4.根据权利要求1所述的CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法，其特征在于，具体步骤包括：A、包被：将包被液加入培养瓶，铺匀平放，在4℃条件下，避光过夜；B、采血：采集外周血15ml,将其加入离心管一中备用；C、淋巴细胞分离液分离：向离心管中加入等体积PBS至30ml，混匀后转移至提前添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁仲恒，贾轲，吕玉静，杨弯，
申请(专利权)人：广州希灵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：