用于产生细胞毒性效应子记忆T细胞以用于癌症的T细胞治疗的方法技术

本文提供了扩增CD161

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生细胞毒性效应子记忆T细胞以用于癌症的T细胞治疗的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年11月6日提交的美国临时申请第62/931,670号的优先权权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
[0003]关于联邦政府资助研究的声明
[0004]本专利技术是根据国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号AI127387在政府支持下进行的。政府享有本专利技术中的某些权利。


[0005]本公开总体上涉及医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学领域。在某些方面，本公开的领域涉及免疫疗法。更具体地，所述领域涉及产生改善的嵌合抗原受体(CAR)T细胞和使用此类细胞的治疗方法。

技术介绍

[0006]胰腺导管腺癌(PDAC)是高度侵袭性肿瘤，尽管积极地进行了手术、放射疗法和高剂量的化疗，其也还具有糟糕的<9％的五年存活率(Ansari等人,2015)。近年来，过继性嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法作为癌症的治疗形式已显示出强大的潜力，特别是用于选择CD19
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恶性肿瘤(Maude等人,2018；Neelapu等人,2017)。CAR构建体由靶向细胞表面肿瘤抗原的单链片段可变区(scFv)、跨膜结构域、铰链区和通常与那些4
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1BB或CD28共刺激分子融合的CD3ζ的胞内信号传导结构域组成(van der Stegen等人,2015)。在试验I期临床试验中，自体间皮素特异性CAR
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T细胞的过继性细胞疗法显示出在一小部分患者中对于化疗难治性转移性人PDAC是安全并且中等有效的(Beatty等人,2018)；然而，针对胰腺肿瘤的CAR T细胞疗法仍然是进展缓慢。事实上，现在，很少有基于CAR的疗法在实体瘤环境中显示出任何显著的功效。
[0007]细胞调节免疫对于病毒感染的关键特性在于建立了长期存活的记忆T细胞群，其通过加速扩增和细胞毒性动力学向后续挑战提供了持久性免疫(Seaman等人,2004)。若干个小组先前已经鉴定了此类记忆T细胞的有趣的亚群(Martin等人,2009；Turtle等人,2009；Northfield等人,2008；Takahashi等人,2006；Assarsson等人,2000；Billerbeck等人,2010；Fergusson等人,2011；Fergusson等人,2016；Fergusson等人,2014)，其可以通过小鼠中自然细胞毒性受体NK1.1或人中CD161的表达来鉴定。与TCR不变体或CD8αα
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CD161
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细胞相比，多克隆αβ细胞群表现出干细胞样自我更新和分化能力、具有来自颗粒酶超家族的显著上调的基因的不同转录谱(Fergusson等人,2011；Fergusson等人,2014)；独特的抗病毒特异性(Fergusson等人,2008；Billerbeck等人,2010；Havenith等人,2012；Neelapu等人,2005)；以及组织归巢特性(Billerbeck等人,2010)。典型地，CD161被称为先天NK细胞受体但是还可以在CD4、CD8和NKT细胞上表达(Fergusson等人,2016)。尽管也在循环中发现，但CD8
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CD161
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细胞由于组织驻留特性和/或外渗倾向在慢性病毒感染以及自主免疫病状期
间有助于组织发病机制(Assarsson等人,2000；Billerbeck等人,2010；Annibali等人,2011)。进一步地，肿瘤驻留免疫浸润物中CD161的高表达水平与NSCLC中显著改善的临床结果和存活率相关(Braud等人,2018)。

技术实现思路

[0008]在第一实施例中，提供了一种体外或离体方法，所述方法包括：(a)获得细胞的样品，所述样品包括CD161
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T细胞；以及(b)在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞，由此提供了CD161
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细胞的数量相较于非CD161
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细胞的数量有所扩增的T细胞群。在某些方面，所述T细胞包括CD8
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CD161
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T细胞。在另外的方面，所述T细胞包括CD4
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CD161
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T细胞。
[0009]IL
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7可以以约5
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20ng/ml存在，IL
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15可以以约2.5
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10ng/ml存在和/或IL
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21可以以约20
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40ng/ml存在，如10ng/ml IL
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7、5ng/ml IL
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15和/或30ng/ml IL
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21。所述方法可以进一步包括在步骤(b)之前，纯化或富集所述样品中存在CD8
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CD161
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细胞的T细胞。所述方法可以进一步包括在步骤(b)之后，纯化或富集所述样品存在CD8
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CD161
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细胞的T细胞。所述富集所述样品中的T细胞可以包括荧光细胞分选、磁珠分离或顺磁珠分离。所述培养可以持续至多7天、14天、21天、28天、35天或42天。
[0010]在一些方面，将所述细胞在包括CD3和/或CD28刺激剂的培养基中进一步培养。在一些方面，所述CD3和/或CD28刺激剂包括CD3和/或CD28结合抗体。在一些方面，将所述细胞在包括CD3、CD28和/或CD161刺激剂的培养基中进一步培养。在一些方面，所述CD3、CD28和/或CD161刺激剂包括CD3、CD28和/或CD161结合抗体。在一些方面，将所述细胞在包括CD3结合抗体、CD28结合抗体，Clec2d和/或CD161刺激抗体的培养基中进一步培养。在一些方面，将所述细胞在包括约0.1到5.0、0.3到3.0或0.5到2.0μg/ml的CD3结合抗体、CD28结合抗体、Clec2d和/或CD161刺激抗体的培养基中进一步培养。
[0011]一方面，将CD8
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CD161
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细胞、CD8
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CD161
neg
细胞和本体PBMC用板结合的抗CD3/CD28刺激，并且在包含10ng/ml IL
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7、5ng/ml IL
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15和30ng/ml IL
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21的细胞因子混合物中扩增(所有来自新泽西州罗基希尔的派普泰克公司(Peprotech,Rocky Hill,NJ))。一方面，针对各自以1ug/mL的抗CD/CD28/CD161的刺激，将CD8
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CD161
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细胞分离培养，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种体外或离体方法，其包括：(a)获得细胞的样品，所述样品包括CD161
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T细胞；以及(b)在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞，由此提供了CD161
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细胞的数量相较于非CD161
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细胞的数量有所扩增的T细胞群。2.根据权利要求1所述的方法，其包括：(a)获得细胞的样品，所述样品包括CD8
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CD161
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T细胞；以及(b)在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞，由此提供了CD8
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CD161
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T细胞的数量相较于非CD8
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CD161
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细胞的数量有所扩增的T细胞群。3.根据权利要求1所述的方法，其包括：(a)获得细胞的样品，所述样品包括CD4
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CD161
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T细胞；以及(b)在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞，由此提供了CD4
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CD161
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T细胞的数量相较于非CD4
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CD161
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细胞的数量有所扩增的T细胞群。4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中将所述细胞在包括CD3和/或CD28刺激剂的培养基中进一步培养。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述CD3和/或CD28刺激剂包括CD3和/或CD28结合抗体。6.根据权利要求4所述的方法，其中将所述细胞在包括CD3结合抗体、CD28结合抗体、Clec2d和/或CD161结合抗体的培养基中进一步培养。7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述细胞在包括约0.1到5.0、0.3到3.0或0.5到2.0μg/ml的CD3结合抗体、CD28结合抗体、Clec2d和/或CD161结合抗体的培养基中进一步培养。8.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其包括：(a1)获得细胞的样品，所述样品包括CD161
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T细胞；(a2)在存在CD3和/或CD28刺激剂的情况下以及在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞；以及(b)在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞。9.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其包括：(a1)获得细胞的样品，所述样品包括CD161
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T细胞；(a2)在存在CD3结合抗体、CD28结合抗体、CD161结合抗体和/或Clec2d的情况下以及在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞；以及(b)在存在IL
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7、IL
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15和IL
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21的情况下培养所述T细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述培养步骤(b)基本上不含CD3结合抗体、CD28结合抗体、Clec2d和/或CD161结合抗体。11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(a2)的所述培养持续约12到72个小时、24到58个小时或24到36个小时。12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(b)的所述培养持续至少约12小时。13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(b)的所述培养持续至少约1天、2天、3天、4
天、5天、6天或7天。14.根据权利要求9所述的方法，其中所述培养步骤(b)基本上不含CD3结合抗体和CD28结合抗体。15.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中IL
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7以约5
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20ng/ml存在，IL
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15以约2.5
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10ng/ml存在和/或IL
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21以约20
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40ng/ml存在，如10ng/mlIL
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7、5ng/mlIL
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15和/或30ng/mlIL
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21。16.根据权利要求1或15所述的方法，其进一步包括在步骤(b)之前，纯化或富集所述样品中存在CD8
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CD161
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细胞的T细胞。17.根据权利要求1或15所述的方法，其进一步包括在步骤(b)之后，纯化或富集所述样品中存在CD8
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CD161
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细胞的T细胞。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中富集所述样品中的T细胞包括荧光细胞分选、磁珠分离或顺磁珠分离。19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法，其中培养持续至多7天、14...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：