本发明专利技术属于分子生物学与生物医药技术领域，提供两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状RNA标志物的应用及诊断试剂盒，具体是环状RNA hsa_circ_0006220和/或hsa_circ_0001666作为诊断标志物在制备快速鉴别早期鼻咽癌的产品中的应用。对于环状RNA hsa_circ_0006220的应用，试剂盒中含有定量检测hsa_circ_0006220的PCR引物对，对于环状RNAhsa_circ_0001666的应用，试剂盒中含有定量检测hsa_circ_0001666的PCR引物对。本发明专利技术中的标志物特异性好、重复性好、可以准确、快速、高通量地运用于早期鼻咽癌的筛查，为快速临床诊断提供依据。为快速临床诊断提供依据。为快速临床诊断提供依据。
【技术实现步骤摘要】
两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状RNA标志物的应用及诊断试剂盒
[0001]本专利技术涉及分子生物学与生物医药
，具体涉及两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状RNA标志物的应用及诊断试剂盒。
技术介绍
[0002]在世卫组织2020年的统计中，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)虽然不是患病率和致死率排名前几位，但全球将近一半的新发病例数和死亡病例数在我国，这需要我国医学研究者引起重视。早发现早治疗是鼻咽癌预后的关键因素。现有的NPC检测方法有EB病毒抗体检测、DNA定量、影像学检查和病理组织活检。EB病毒抗体和DNA定量检测有安全、简便、快速、成本低和易推广等优点，但灵敏度和特异度较低，漏诊率高，对于早期NPC诊断临床多采用两种及多种检测相结合；影像学检查直观，但不适用于早期检测且费用高；病理组织活检是NPC诊断的金标准，但有创且因取材问题依旧容易导致漏诊，难以发现早期NPC。因此，更为有效的NPC早期诊断标志物有待深入研究。
技术实现思路
[0003]本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状RNA标志物的应用及诊断试剂盒，有利于快速简便诊断早期鼻咽癌，降低癌症死亡率。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0005]专利技术人对鼻咽癌患者血清及组织进行高通量测序和基因芯片检测，通过对比分析对照组、早期鼻咽癌和晚期鼻咽癌血清与组织中环状RNA表达情况，从中筛选出在早期鼻咽癌血清和组织中均存在特异表达的标志物hsa_circ_0006220和hsa_circ_0001666，经过反复筛选，设计成本专利技术的引物对，以F为上游引物，R为下游引物，所形成的产物必须跨过剪接位点以确保环状结构。
[0006]环状RNA hsa_circ_0006220和/或hsa_circ_0001666作为诊断标志物在制备快速鉴别早期鼻咽癌的产品中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0006220具有如SEQ ID NO：1所示的序列，所述环状hsa_circ_0001666具有如SEQ ID NO：2所示的序列。
[0007]本专利技术中，对于环状RNA hsa_circ_0006220的应用，所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0006220的PCR引物对和内参基因β
‑
Actin特异性引物，所述PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：TCTGTTTGCATCTACCCTGCT，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：CACACTCCTCCTTGGTCTTGG；所述内参基因β
‑
Actin引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0008]本专利技术中，对于环状RNAhsa_circ_0001666的应用，所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0001666的PCR引物对和内参基因β
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Actin特异性引物，所述PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示：CTGCCTAGCTGTCAAGGAGTGG，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示：TCCGGGAAAGGATCTGGAATG；所述内参基因β
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Actin引物对中，上游引物的
核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0009]本专利技术中，优选地，所述的产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。
[0010]本专利技术中，优选地，所述定量检测hsa_circ_0006220或hsa_circ_0001666的方法包括以下步骤：
[0011]1)从待测血清样品中提取RNA，得到RNA样品；
[0012]2)向提取出的RNA样品先去除基因组DNA反应后加入反转录酶，将RNA反转录成cDNA；
[0013]3)向步骤2)所得cDNA中加入PCR引物对F/R和饱和荧光染料，在特定条件下进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
[0014]4)对步骤3)所得扩增产物通过熔解曲线分析确定扩增产物的特性排除引物二聚体，每个样本设置3个复孔，设置固定阈值记录Ct值，取3次PCR结果计算平均Ct值，采用相对定量法计算各样本的表达水平。
[0015]上述定量检测方法中，优选地，所述步骤2)中逆转录体系如下：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl，RT Primer Mix 1.0μl，5
×
PrimeScript Buffer 2for Real Time 4.0μl，RNase Free dH2O 4.0μl；逆转录反应程序为：37℃15min，85℃5sec。
[0016]上述定量检测方法中，优选地，所述步骤3)中PCR扩增反应体系如下：TB Geen Premix Ex Taq
TMⅡ(Ti RNaseH Plus)10μl,cDNA模板2μl，10μM上下游引物各0.8μl，ddH2O6μl,ROX 0.4μl；PCR扩增反应的程序为：95℃预变性30sec,95℃5sec,60℃34sec,共40个循环，在60℃时采集荧光信号。
[0017]快速鉴定早期鼻咽癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有定量检测hsa_circ_0006220的PCR引物对和/或定量检测hsa_circ_0001666的PCR引物对。
[0018]上述试剂盒中，优选地，所述定量检测hsa_circ_0006220的PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：TCTGTTTGCATCTACCCTGCT，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：CACACTCCTCCTTGGTCTTGG。
[0019]上述试剂盒中，优选地，所述定量检测hsa_circ_0001666的PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示：CTGCCTAGCTGTCAAGGAGTGG，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示：TCCGGGAAAGGATCTGGAATG。
[0020]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0021]1、本专利技术结合qRT
‑
PCR与液体活检技术，筛选早期鼻咽癌患者血清中差异表达的circRNAs，通过反复筛选，最后找到两个有差异的特异基因位点，通过qRT
‑
PCR扩增得到血清中circRNAs的表达量。
[0022]2、本专利技术qRT
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PCR操作简单，全程只需2h，极大地缩短了分析时间，荧光饱和染料廉价易得，试验方法特异性好、重复性好、可以准确、快速、高通量地运用于早期鼻咽癌的筛查，为快速临床诊断提供依据。
附图说明
[0023]图1为本专利技术提供的hsa_circ_本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.环状RNA hsa_circ_0006220和/或hsa_circ_0001666作为诊断标志物在制备快速鉴别早期鼻咽癌的产品中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0006220具有如SEQ ID NO：1所示的序列，所述环状hsa_circ_0001666具有如SEQ ID NO：2所示的序列。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：对于环状RNA hsa_circ_0006220的应用，所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0006220的PCR引物对和内参基因β
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Actin特异性引物，所述PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：TCTGTTTGCATCTACCCTGCT，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：CACACTCCTCCTTGGTCTTGG；所述内参基因β
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Actin引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：TCACCAACTGGGACGACATG，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：GTCACCGGAGTCCATCACGAT。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于：对于环状RNAhsa_circ_0001666的应用，所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0001666的PCR引物对和内参基因β
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Actin特异性引物，所述PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示：CTGCCTAGCTGTCAAGGAGTGG，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示：TCCGGGAAAGGATCTGGAATG；所述内参基因β
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Actin引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：TCACCAACTGGGACGACATG，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：GTCACCGGAGTCCATCACGAT。4.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述的产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。5.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于：所述定量检测hsa_circ_0006220或hsa_circ_0001666的方法包括以下步骤：1)从待测血清样品中提取RNA，得到RNA样品；2)向提取出的RNA样品先去除基因组...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐石伏，邢利，任明君，闭婉英，王万平，龙涌文，
申请(专利权)人：柳州市人民医院，
类型：发明
国别省市：
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