KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法及应用，缺氧下骨肉瘤组织的KCNJ2的表达水平上调，KCNJ2与HIF1α结合，减少蛋白酶体对HIF1α的降解，维持细胞中HIF1α的蛋白水平，促进HIF1α的核转位；在增强HIF1α相关基因表达水平的同时，与KCNJ2的启动子结合，上调KCNJ2的表达水平，形成正反馈调节机制，导致HIF1α和KCNJ2持续上调，进而增强骨肉瘤细胞的转移能力。本发明专利技术以骨肉瘤为对象，证明KCNJ2/HIF1α相互作用及其对HIF1α的结合保护作用，挖掘了新的HIF1α调控机制，为临床治疗骨肉瘤提供可行的治疗靶点以及治疗策略。治疗靶点以及治疗策略。治疗靶点以及治疗策略。

【技术实现步骤摘要】
KCNJ2/HIF1
α
正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，骨肉瘤是骨组织中最常见的原发性恶性肿瘤之一。骨肉瘤的发病率接近于百万分之三，主要影响青少年和青壮年，且男性比例较女性大；骨肉瘤大多发生在四肢长骨干骺端。骨肉瘤的进程迅速，死亡率极高。外科手术是骨肉瘤的主要治疗方法之一。目前，对局限性的骨肉瘤患者治疗后的5年生存率可达60～70％；然而，对已发生骨肉瘤远处转移的患者，临床治疗后5年生存率不足30％。缺氧是骨肉瘤组织特征之一，也是促进骨肉瘤转移的重要因素，但促进机制还不清楚。因此，明确骨肉瘤远处转移的分子机制，对骨肉瘤的临床治疗有着重要意义。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：缺氧是骨肉瘤组织特征之一，也是促进骨肉瘤转移的重要因素，但促进机制还不清楚。
[0004]现有技术不能为骨肉瘤的治疗提供新的治疗靶点药物理论依据。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法及应用。
[0006]本专利技术是这样实现的，一种KCNJ2在制备治疗骨肉瘤靶点药物中的用途。
[0007]进一步，缺氧下，KCNJ2与HIF1α结合，形成KCNJ2/HIF1α正反馈环路，在制备增强骨肉瘤细胞的转移能力药物上的应用。
[0008]本专利技术另一目的在于提供一种KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法包括：
[0009]缺氧下，骨肉瘤组织的KCNJ2的表达水平上调，KCNJ2与HIF1α结合，减少蛋白酶体对HIF1α的降解，维持细胞中HIF1α的蛋白水平，促进HIF1α的核转位；在增强HIF1α相关基因表达水平的同时，与KCNJ2的启动子结合，上调KCNJ2的表达水平，从而形成正反馈调节机制，导致HIF1α和KCNJ2持续上调，进而增强骨肉瘤细胞的转移能力。
[0010]进一步，所述KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法包括以下步骤：
[0011]步骤一，分析KCNJ2在骨肉瘤中的表达；
[0012]步骤二，KCNJ2对骨肉瘤细胞转移的功能学分析；
[0013]步骤三，KCNJ2调控HIF1α蛋白稳定性及下游靶基因表达分子机制分析；
[0014]步骤四，缺氧条件下，KCNJ2受HIF1α转录调控的分子机制分析。
[0015]进一步，所述步骤一中的KCNJ2在骨肉瘤中的表达包括：
[0016](1)从GEO数据库下载包含转移能力强和转移能力弱的骨肉瘤细胞系的基因表达谱分析在骨肉瘤转移能力强的细胞系中高表达的基因，鉴定KCNJ2在骨肉瘤强转移和弱转
移的细胞系中的表达；
[0017](2)收集骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织，免疫组化检测KCNJ2在骨肉瘤组织以及癌旁组织的表达；
[0018](3)培养正常成骨细胞hFOB1.19、低转移能力细胞系U2OS和MG63、高转移能力细胞系143B和MMNG，免疫印迹检测KCNJ2在细胞系中的蛋白表达水平；
[0019](4)根据临床资料，将收集的骨肉瘤组织分为低I
‑
II和高III
‑
IV肿瘤分级组，免疫组化检测两组患者组织内KCNJ2的蛋白表达水平；
[0020](5)根据临床资料，进行卡方检验，分析KCNJ2的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结侵袭以及远处转移的相关性；
[0021](6)对患者的生存预后进行随访，卡普兰生存分析KCNJ2高表达与低表达患者的生存差异；
[0022](7)根据临床资料，进行单因素和多因素方差分析，判断KCNJ2是否作为独立判断预后的因素。
[0023]进一步，所述骨肉瘤细胞系的基因表达谱包括GSE18947、GSE49003和GSE66673。
[0024]进一步，所述步骤二中的KCNJ2对骨肉瘤细胞转移的功能学分析包括：
[0025]利用靶向KCNJ2的短发卡RNA和无义序列构建sh
‑
KCNJ2和NC细胞：
[0026]利用KCNJ2过表达慢病毒以及空载体病毒构建Lv
‑
KCNJ2和Vector细胞。
[0027]进一步，所述利用靶向KCNJ2的短发卡RNA和无义序列构建sh
‑
KCNJ2和NC细胞包括：
[0028](1)将sh
‑
KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞U2OS和43B置于六孔板中，划痕实验检测各组细胞的迁移能力；
[0029](2)将sh
‑
KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中，transwell实验检测各组细胞的侵袭能力；
[0030](3)裸鼠尾静脉注射sh
‑
KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞143B细胞后，观察各组裸鼠的生存率；安乐死裸鼠后，检测各组裸鼠肺内的转移灶数量。
[0031]进一步，所述利用KCNJ2过表达慢病毒以及空载体病毒构建Lv
‑
KCNJ2和Vector细胞包括：
[0032](1)将Lv
‑
KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中，划痕实验检测各组细胞的迁移能力；
[0033](2)将Lv
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KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中，transwell实验检测各组细胞的侵袭能力；
[0034](3)裸鼠尾静脉注射Lv
‑
KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞143B细胞后，观察各组裸鼠的生存率；安乐死裸鼠后，检测各组裸鼠肺内的转移灶数量。
[0035]进一步，所述步骤三中的KCNJ2调控HIF1α蛋白稳定性及调控其下游靶基因的表达的分子机制分析包括：
[0036](1)应用抗KCNJ2的抗体，免疫沉淀KCNJ2以及相互结合的蛋白后，采用质谱的手段鉴定KCNJ2的结合蛋白；
[0037](2)应用抗KCNJ2的抗体，沉淀KCNJ2以及相互结合的蛋白后，进行免疫印迹，检测KCNJ2与HIF1α的表达；
[0038](3)根据KCNJ2和HIF1α蛋白的不同功能域，构建质粒；以GST pull down的技术分析KCNJ2与HIF1α结合的肽段；
[0039](4)KCNJ2和HIF1α蛋白的不同功能域，构建质粒；质粒导入至双酵母杂交系统中，分析KCNJ2与HIF1α结合的肽段；
[0040](5)将NC、sh
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KCNJ2、Vector和Lv
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KCNJ2组细胞置于21％常氧和0.5％缺氧条件下，免疫印迹检测各组细胞HIF1α的表达；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种KCNJ2在制备治疗骨肉瘤靶点药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，缺氧下，KCNJ2与HIF1α结合，形成KCNJ2/HIF1α正反馈环路，在制备增强骨肉瘤细胞的转移能力药物上的应用。3.一种如权利要求1～2任意一项所述用途中KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法，其特征在于，所述KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法包括：缺氧下，骨肉瘤组织的KCNJ2的表达水平上调，KCNJ2与HIF1α结合，减少蛋白酶体对HIF1α的降解，维持细胞中HIF1α的蛋白水平，促进HIF1α的核转位；在增强HIF1α相关基因表达水平的同时，与KCNJ2的启动子结合，上调KCNJ2的表达水平，从而形成正反馈调节机制，导致HIF1α和KCNJ2持续上调，进而增强骨肉瘤细胞的转移能力。4.如权利要求3所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法，其特征在于，所述KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法包括以下步骤：步骤一，分析KCNJ2在骨肉瘤中的表达；步骤二，KCNJ2对骨肉瘤细胞转移的功能学分析；步骤三，KCNJ2调控HIF1α蛋白稳定性及下游靶基因表达分子机制分析；步骤四，缺氧条件下，KCNJ2受HIF1α转录调控的分子机制分析。5.如权利要求4所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法，其特征在于，所述步骤一中的KCNJ2在骨肉瘤中的表达包括：(1)从GEO数据库下载包含转移能力强和转移能力弱的骨肉瘤细胞系的基因表达谱分析在骨肉瘤转移能力强的细胞系中高表达的基因，鉴定KCNJ2在骨肉瘤强转移和弱转移的细胞系中的表达；(2)收集骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织，免疫组化检测KCNJ2在骨肉瘤组织以及癌旁组织的表达；(3)培养正常成骨细胞hFOB1.19、低转移能力细胞系U2OS和MG63、高转移能力细胞系143B和MMNG，免疫印迹检测KCNJ2在细胞系中的蛋白表达水平；(4)根据临床资料，将收集的骨肉瘤组织分为低I
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II和高III
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IV肿瘤分级组，免疫组化检测两组患者组织内KCNJ2的蛋白表达水平；(5)根据临床资料，进行卡方检验，分析KCNJ2的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结侵袭以及远处转移的相关性；(6)对患者的生存预后进行随访，卡普兰生存分析KCNJ2高表达与低表达患者的生存差异；(7)根据临床资料，进行单因素和多因素方差分析，判断KCNJ2是否作为独立判断预后的因素；所述骨肉瘤细胞系的基因表达谱包括GSE18947、GSE49003和GSE66673。6.如权利要求4所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法，其特征在于，所述步骤二中的KCNJ2对骨肉瘤细胞转移的功能学分析包括：利用靶向KCNJ2的短发卡RNA和无义序列构建sh
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KCNJ2和NC细胞：利用KCNJ2过表达慢病毒以及空载体病毒构建Lv
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KCNJ2和Vector细胞；所述利用靶向KCNJ2的短发卡RNA和无义序列构建sh
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KCNJ2和NC细胞包括：(1)将sh
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KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞U2OS和43B置于六孔板中，划痕实验检测各组细胞的
迁移能力；(2)将sh
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KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中，transwell实验检测各组细胞的侵袭能力；(3)裸鼠尾静脉注射sh
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KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞143B细胞后，观察各组裸鼠的生存率；安乐死裸鼠后，检测各组裸鼠肺内的转移灶数量。7.如权利要求6所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法，其特征在于，所述利用KCNJ2过表达慢病毒以及空载体病毒构建Lv
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KCNJ2和Vector细胞包括：(1)将Lv
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KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中，划痕实验检测各组细胞的迁移能力；(2)将Lv
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KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中，transwell实验检测各组细胞的侵袭能力；(3)裸鼠尾静脉注射Lv
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KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞143B细胞后，观察各组裸鼠的生存率；安乐死裸鼠后，检测各组裸鼠肺内的转移灶数量。8.如权利要求4所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法，其特征在于，所述步骤三中的KCNJ2调控HIF1α蛋白稳定性及调控其下游靶基因的表达的分子机制分析包括：(1)应用抗KCNJ2的抗体，免疫沉淀KCNJ2以及相互结...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈茂，田晓滨，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：