具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其包括，纳米颗粒核；外膜，其包裹所述纳米颗粒核；所述外膜来源于CD4

【技术实现步骤摘要】
具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒及其制备与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其由细胞膜包裹，以能够用于激活免疫或治疗用途。

技术介绍

[0002]慢性牙周炎是一种全球流行的疾病，可能导致牙齿脱落并导致全身性并发症，并伴有许多严重的健康问题。在慢性牙周炎的过程中，共生的口腔微生物群失调是牙周炎的始动因素，而宿主的过度激活的免疫反应则导致了慢性炎症和牙周组织连带破坏。慢性牙周炎的常规非手术治疗方法主要是去除微生物群及牙菌斑以及抗生素的辅助使用。然而，目前这些方法对于牙周微环境中失调的免疫反应和已经存在的慢性炎症的缓解作用非常有限。因此，通过控制过度的免疫活化来解决炎症并减缓牙周炎进展的方法是非常具有前景的，但是目前研究少有报道。
[0003]牙周膜中免疫稳态的维持依赖于相互制约且精确调节的免疫反应，其中调节性T(Treg)细胞(一种主要的免疫抑制性T细胞亚群)的用于对于保证适当程度的免疫炎症反应同时保证组织破坏最小化是必不可少的。人体免疫系统的免疫稳态的维持依赖于免疫激活反应和免疫抑制反应的相互协调，调节性T细胞(Treg细胞)则作为一种主要免疫抑制T细胞细胞亚型对免疫激活反应进行拮抗。目前已有大量研究表明Treg细胞的比例在慢性牙周炎患者的病灶中显著上调。Treg细胞的免疫抑制特性主要是通过分泌调节细胞因子以及依靠细胞膜表面的免疫抑制性配体蛋白与靶细胞的直接相互作用来发挥的。已经进行了一些尝试来增加牙周损伤中Treg细胞的数量和功能，一种负载有 CCL22的微粒将Tregs招募到牙周炎病灶中并显著减少了鼠和犬牙周炎模型中的炎症细胞浸润以及牙槽骨吸收。然而，基于纳米颗粒的免疫抑制纳米制剂虽然能够一定程度上改善其副作用，但由于药物半衰期短，通常仍需要频繁和长期的给药仍不足以绕过药物治疗的固有缺点。
[0004]近年来，基于细胞的Treg治疗已经引起了人们的广泛关注，其用于治疗自身免疫性疾病(如I型糖尿病)和同种异体免疫排斥相关的疾病(如移植物抗宿主病(GvHD))。然而，Treg活细胞的过继转移治疗策略虽然已进入临床研究，但是仍然面临Treg细胞中Foxp3转录因子表达的不稳定性而导致的表型不稳定的问题，这有可能会使免疫抑制性Treg表型转变为促炎的T细胞，因此反而加剧疾病。对于牙周炎等炎性疾病，采用基于药物来诱导Treg在局部趋化或增殖的方法也可能面临以下问题：趋化剂的使用可能会同时募集促炎激活的T淋巴细胞到病灶，此外，在复杂的微环境下，富含促炎细胞因子的情况下，募集的Treg细胞可能会失去免疫抑制表型。因此，申请人描述开发了人工纳米级Treg细胞，该纳米细胞通过其表面的膜蛋白来发挥多种免疫调节功能，从而解决局部牙周炎症和组织损伤。

技术实现思路

[0005]本专利技术了涉及了Treg细胞膜包裹的纳米颗粒，模仿Treg细胞介导的内源性免疫调节。
[0006]本专利技术一方面涉及具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其包括，纳米颗粒核；外膜，其包裹所述纳米颗粒核；所述外膜来源于CD4
+
CD25
+
Foxp3 +
的Treg细胞的细胞膜，和所述外膜的膜蛋白与Treg细胞上的膜蛋白定位一致。
[0007]具体地，所述纳米颗粒核包括具有生物相容性的或合成的材料，其选自聚(乳酸
‑
乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸以及聚谷氨酸；优选的，所述纳米颗粒核包括聚 (乳酸
‑
乙醇酸)共聚物(PLGA)。
[0008]具体地，所述仿生纳米颗粒的水合直径较纳米颗粒核增大，而表面电位较纳米颗粒核减小并与所述Treg细胞膜衍生的囊泡相似。
[0009]具体地，所述仿生纳米颗粒由纳米颗粒核和外膜反复挤出得到；所述外膜和纳米颗粒核的比例为1:1。
[0010]具体地，所述仿生纳米颗粒至少包括Treg细胞膜的特征性膜蛋白 CTLA
‑
4、LAG
‑
3、CD39、CD73和CD27；优选地，所述仿生纳米颗粒能够结合巨噬细胞、DC和T细胞，从而抑制巨噬细胞分化，抑制DC细胞成熟和 T细胞的增殖和活化。
[0011]所述仿生纳米颗粒通过与破骨细胞上的共刺激分子CD80/86发生的配体
‑ꢀ
受体相互作用，以抑制TRAP
+
破骨细胞的生成。
[0012]所述仿生纳米颗粒能够通过与膜共刺激分子相互作用抑制DC细胞成熟和免疫刺激功能。
[0013]所述仿生纳米颗粒能够干扰CD4
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T细胞的增殖和细胞因子的产生；优选地，所述仿生纳米颗粒抑制Ki67
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、TNF
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α
+
、IFN
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γ
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T细胞。所述仿生纳米粒子抑制CD4
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TNF
‑
α
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T细胞、CD4
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IFN
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γ
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T细胞、分泌型CD4
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IL
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17a
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细胞以及CD4
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CD25
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Foxp3
+
Treg细胞的生成。
[0014]本专利技术另一方面涉及一种多重免疫调节的方法，其包括施用上述的仿生纳米颗粒；优选地是用于牙周微环境的免疫调节，以减轻炎症或牙周组织损伤。
[0015]本方还涉及一种药物组合物，其用于治疗牙周炎及炎症引起的牙周组织损伤，其包括上述的仿生纳米颗粒，和/或药学上可接受的载体和/或赋形剂。
附图说明
[0016]图1是本专利技术设计的TNPs的制备和特征。图1a为人造纳米颗粒Treg细胞的示意图，其设计用于抑制牙龈中的过度免疫反应以改善牙周炎并减轻慢性牙周炎中牙槽骨的吸收；图1b为NP和用乙酸铀酰染色的TNP的代表性TEM图像，比例尺：200nm。图1c和1d为通过DLS测量的TNPs的水合尺寸(c)和ζ电势(d)的结果。图1e为通过蛋白质印迹测定法检测的Treg裂解物、Treg膜囊泡和TNP的特征性膜蛋白标志物的表达。图1f为用PE标记的抗小鼠CTLA
‑
4抗体染色的Treg细胞和TNPs的荧光强度。数据表示为平均值
±
s.d。统计学意义通过两尾t检验进行分析。NS：无显著性。
[0017]图2是TNP抑制巨噬细胞向破骨细胞分化的作用；图2a为与TNP或NP 孵育后，细胞的典型共聚焦图像。蓝色，绿色和红色分别代表细胞核，细胞膜和纳米颗粒。比例尺：10μm。图2b为通过流式细胞仪分析定量分析与巨噬细胞结合的纳米颗粒(n＝3，未配对的两尾t检验)。图2c为用TNP或NP 处理的巨噬细胞的代表性的TRAP染色图像，比例尺：200μm。图2d为与 TNP或NP孵育后，TRAP阳性多核破骨细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其包括，纳米颗粒核；外膜，其包裹所述纳米颗粒核；所述外膜来源于CD4
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CD25
+
Foxp3
+
的Treg细胞的细胞膜，和所述外膜的膜蛋白与天然Treg细胞的膜蛋白定位一致。2.如权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒核包括具有生物相容性的或合成的材料，其选自聚(乳酸
‑
乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸以及聚谷氨酸；优选的，所述纳米颗粒核包括聚(乳酸
‑
乙醇酸)共聚物(PLGA)。3.如权利要求1或2所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒的水合直径较纳米颗粒核增大，和表面电位较纳米颗粒核减小并与所述Treg细胞膜衍生的囊泡相似。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒由纳米颗粒核和外膜反复挤出得到；优选地，所述外膜和纳米颗粒核的比例为1:1。5.如权利要求1或2所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒至少包括Treg细胞膜的特征性膜蛋白CTLA
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4、LAG
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3、CD39、CD73和CD27；优选地，所述仿生纳米颗粒能够结合巨噬细胞、树突状细胞(DC)和T细胞，从而抑制巨噬细胞向破骨细胞的分化，抑制DC的成熟和T细胞的增殖和活化。6.如权利要求1
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5任一项所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒通过与破骨细胞上的共刺激分子CD80/86发生配体
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘尽尧，陆尔奕，李双，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：