一种岩藻糖基化软骨素及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种岩藻糖基化软骨素及其制备方法和应用。本发明专利技术利用酶的底物宽泛性，筛选不同来源的岩藻糖基转移酶进行底物适应性研究，构建多酶级联催化反应体系，开发了高效的酶法合成岩藻糖基化软骨素的方法，采用本发明专利技术的方法可以在软骨素糖链的不同位点实现不同程度的岩藻糖基化修饰，为岩藻糖基硫酸软骨素的工业化生产奠定了基础，推动糖类抗凝药物的开发。物的开发。物的开发。

【技术实现步骤摘要】
一种岩藻糖基化软骨素及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及酶工程技术及合成生物学领域，特别涉及一种岩藻糖基化软骨素及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着人类生活水平的普遍提高和人口老龄化进程的加快，血栓性疾病日益增多，已成为一个严重影响人类生命健康的问题。肝素和低分子肝素(LMWHs)作为抗凝剂被广泛应用于血栓性疾病的治疗。肝素和低分子肝素在治疗期间有严重出血的风险，并且不能口服。因此，研究人员们一直在继续寻找更有效和更安全的抗凝药物。岩藻糖基化硫酸软骨素(FuCS)是一种从海参中分离出来的结构独特的活性多糖，具有显著的抗凝和抗血栓活性，可以作为一种潜在的候选药物，其合成制备以及生物学功能研究成为了国内外科学家关注的热点。然而，由于均质寡糖的缺乏，阻碍了进一步的构效关系研究。
[0003]目前，FuCS的获得主要有海参提取和化学法合成两种方法。提取法受海参品质和来源的限制，无法获得结构明确的FuCS糖链，限制了构效关系和生物研究(如ACS Chem Biol 2020,15(8),2232
‑
2246.或CarbohydrPolym 2017,165,7
‑
12.或CarbohydrPolym 2021,262, 117969.)；化学合成FuCS近年来得到了长足发展，但受糖链复杂性影响，依然存在步骤繁琐、收率低等问题，无法做到经济高效合成(如Angew Chem Int Ed Engl 2018,57(39), 12880
‑
12885.或J Org Chem 2020,85,24,15908
–
15919.)。
[0004]FuCS糖链结构是由硫酸化修饰的二糖重复单元与GlcA O
‑
3位分支修饰岩藻糖残基构成，其二糖重复单元主要由糖醛酸(葡萄糖醛酸GlcA)和N
‑
乙酰氨基半乳糖(GalNAc)通过β糖苷键连接构成。不同物种来源的FuCS在硫酸化位点及岩藻糖基化分支的数目上存在差异，目前现有技术中尚未有酶法合成FuCS寡糖片段的相关报道，鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术克服了现有技术中存在的不足，提供了一种岩藻糖基化软骨素及其制备方法和应用。
[0006]本专利技术的第一方面提供了一种岩藻糖基化软骨素的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
[0007]将L
‑
岩藻糖基转移酶与底物GDP
‑
L
‑
岩藻糖和软骨素寡糖混合，酶促反应，得到岩藻糖基化软骨素。
[0008]进一步地，所述软骨素寡糖中可岩藻糖基化的GlcA与GDP
‑
L
‑
岩藻糖(鸟苷二磷酸岩藻糖)的摩尔比为0.5
‑
2:1
‑
4，优选地，所述摩尔比为0.5
‑
1.5:1
‑
3.5，更优选地，所述摩尔比为 1:1
‑
3.5(如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5)。
[0009]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述软骨素寡糖中可岩藻糖基化的GlcA与GDP
‑
L
‑ꢀ
岩藻糖(鸟苷二磷酸岩藻糖)的摩尔比为1:2。
[0010]进一步地，所述反应的pH为6.5
‑
8.5，优选地，所述反应的pH为7
‑
8，更优选地，所述
反应的pH为7.5。
[0011]进一步地，所述反应的温度为30
‑
45℃，优选的，所述反应的温度为35
‑
40℃，更优选的，所述反应的温度为37℃。
[0012]进一步地，所述反应的时间为10
‑
30h，优选的，所述反应的时间为10
‑
25h，更优选的，所述反应的时间为12
‑
24h。
[0013]进一步地，所述L
‑
岩藻糖基转移酶的浓度为0.1
‑
2mg/mL，优选的，所述L
‑
岩藻糖基转移酶的浓度为0.5
‑
1.5mg/mL，更优选的，所述L
‑
岩藻糖基转移酶的浓度为1mg/mL。
[0014]进一步地，所述的软骨素寡糖具有如下结构：
[0015][0016]进一步地，所述n1为选自1
‑
10的整数(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
[0017]优选地，所述的n1为选自1
‑
5的整数，更优选地，所述的n1为选自1
‑
3的整数。
[0018]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的软骨素寡糖选自如下结构：
[0019][0020][0021]进一步地，所述L
‑
岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示；
[0022]进一步地，所述的L
‑
岩藻糖基转移酶Bfα1,3FT的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0023]进一步地，所述的L
‑
岩藻糖基转移酶Hpα1,3FT S45F V30G的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0024]进一步地，所述的L
‑
岩藻糖基转移酶选自α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶或α
‑
1,3
‑
岩藻糖基转移酶中的一种。
[0025]优选地，所述的L
‑
岩藻糖基转移酶为α
‑
1,3
‑
岩藻糖基转移酶。
[0026]优选地，所述的L
‑
岩藻糖基转移酶选自：SEQ ID NO：3
‑
4中任一项所表示的多肽、SEQID NO3
‑
4中任一项所表示的多肽的功能性变体、SEQ ID NO：3
‑
4中的任一项所表示的多肽的功能性片段以及SEQ ID NO：3
‑
4中任一项所表示的多肽的功能性片段的功能性变体。
[0027]进一步地，所述L
‑
岩藻糖基转移酶的来源为：脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、胆型螺杆菌(H.bilis)、朱奈德螺杆菌 (H.cinaede)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)和普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)中的一种，优选地，所述L
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种岩藻糖基化软骨素的制备方法，所述的方法包括如下步骤：将L
‑
岩藻糖基转移酶与底物GDP
‑
L
‑
岩藻糖和软骨素寡糖混合，酶促反应，得到岩藻糖基化软骨素；优选地，所述的L
‑
岩藻糖基转移酶Bfα1,3FT的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；优选地，所述的L
‑
岩藻糖基转移酶Hpα1,3FT S45F V30G的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：使用软骨素寡糖，在非还原端结构为D
‑
GalNAc1
‑4‑
β
‑
D
‑
GlcA的GlcA O
‑
3位使用L
‑
岩藻糖基转移酶Hpα1,3FT S45F V30G催化进行单一位点的岩藻糖基化修饰。3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：使用软骨素寡糖，在D
‑
GalNAc1
‑4‑
β
‑
D
‑
GlcA结构的所有GlcA O
‑
3位使用L
‑
岩藻糖基转移酶Bfα1,3FT催化进行岩藻糖基化修饰。4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：当岩藻糖基化软骨素寡糖的非还原端大于等于两个糖未岩藻糖基化修饰时，首先使用软骨素合成酶PmCS催化延伸岩藻糖基化软骨素的主链，然后在结构为D
‑
GalNAc1
‑4‑
β
...

【专利技术属性】
技术研发人员：房俊强，杨林，李爽，凌沛学，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：