一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法及其应用，属于医学技术领域。该方法包括以下步骤：(1)收集肝癌组织标本及对照癌旁标本；(2)提取样本DNA进行全外显子组测序；(3)生物信息学分析；(4)结合样本的病理学信息特征进行个性化分析，得到与肝癌多结节发生密切相关的驱动基因并进行功能富集。本发明专利技术筛选得到了多个与人类肝癌发生有关的驱动基因，如：MTOR、CDKN1A、MACF1、CHD8和KDM6B等。因此，本发明专利技术为多结节肝癌的精准医疗提供了科学依据。依据。依据。

【技术实现步骤摘要】
一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法及其应用


[0001]本专利技术属于医学
，尤其涉及一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法及其应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈上升趋势。而在中国，肝癌发病率已位居恶性肿瘤第4，并且是第2位肿瘤致死病因。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的肝癌类型，约占病例总数的90％。目前，肝癌的外科治疗包括肝切除术和肝移植术仍是肝癌病人获得长期生存最重要的手段。但手术切除治疗后面临的转移和高复发率问题是制约肝癌患者术后生存率的一大难题。
[0003]研究表明，肿瘤数目可作为影响肝癌患者术后早期复发的独立危险因素，对预后判断有价值。但以往的研究主要通过癌结节间的影像学特征和病理组织学表现来区分不同的转移灶，该方法不适用于早期转移或中低分化水平的肝癌患者，不能有效的阐明肝癌结节间的异质性。因此，寻找新的分子标记，更好的评估肝癌患者的转移潜能和预后进而指导临床决策，及时采取有效的个体化防治方案是提高肝癌疗效的关键。
[0004]全外显子组测序技术能够有效识别蛋白质编码区中的基因突变，是精准医学背景下用于检测致病突变基因和易感基因位点的常用技术。应用该技术，研究人员发现了多个与人类肝癌发生有关的驱动基因，如：TP53、ARID1A、CTNNB1、CDKN2A和PTEN等。因此，本研究选取了具有单个和多个肝癌结节背景的肝癌病人样本进行外显子组测序，以期揭示多结节肝癌发生发展中的体细胞突变图谱和可能的调控模式，为多结节肝癌的精准医疗提供科学依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术一方面提供一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
[0006](1)收集肝癌组织标本及对照癌旁标本；
[0007](2)提取样本DNA进行全外显子组测序；
[0008](3)生物信息学分析。
[0009]优选地，所述步骤(2)的具体操作为：采取Covaris技术将检测合格的DNA样品打断成180
‑
220bp的片段，采用Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome V3/Agilent SureSelect HumanAll Exon V6外显子捕获试剂盒构建文库，经Illumina Nova Seq6000系列测序仪完成双端测序。
[0010]更优选地，所述步骤(3)的具体操作为：原始下机数据进行过滤后得到高质量数据，将之与参考基因组序列进行比对，后再完成生物信息学分析。
[0011]更优选地，还包括步骤(4)结合样本的病理学信息特征进行个性化分析，得到与肝癌多结节发生密切相关的驱动基因并进行功能富集。
[0012]更优选地，筛选得到的肝癌结节相关驱动基因包括MTOR、CDKN1A、MACF1、CHD8和KDM6B等。
[0013]本专利技术的另一方面提供上述筛选方法在肝癌多结节相关驱动基因筛选中的应用。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0015]本专利技术筛选得到了多个与人类肝癌结节发生发展有关的驱动基因，如：MTOR、CDKN1A、MACF1、CHD8和KDM6B等。因此，本专利技术为多结节肝癌的精准医疗提供了科学依据。
附图说明
[0016]图1为实施例1中单结节组和多结节组体细胞SNV在基因组不同区域的分布情况图。
[0017]图2.1为实施例1中体细胞SNV突变图谱。
[0018]图2.2为实施例1中突变特征分布图。
[0019]图3.1为实施例1中突变特征贡献图。
[0020]图3.2为实施例1中突变特征余弦相似度热图。
[0021]图4为实施例1中单结节肝癌与多结节肝癌驱动基因韦恩图。
[0022]图5.1为实施例1中多结节特有驱动基因GO注释结果图。
具体实施方式
[0023]实施例1
[0024]1.1病例收集
[0025]本研究的样本来自广西医科大学肿瘤附属医院接受外科手术的14位HCC患者，收集相应肿瘤组织标本及对照癌旁标本共54例(其中，对于存在多个肝癌结节的患者，选取对应数量的癌结节组织)。所有病例的HCC诊断均由广西医科大学肿瘤附属医院病理科医生进行组织学证实，所有组织样本经外科手术切除后立即放置于液氮中冻存。本研宄符合赫尔辛基宣言原则，用于开展实验的患者样本以及研究方案均经医院中心伦理委员会批准，每位患者均已签署知情同意书。
[0026]1.2全外显子组测序
[0027]54例组织样本的DNA提取采用OMEGATissueDNAkit。经检测合格的DNA样品采取Covaris技术打断成180
‑
220bp的片段。采用RocheNimbleGenSeqCapEZExomeV3/AgilentSureSelectHumanAllExonV6外显子捕获试剂盒构建文库，经IlluminaNovaSeq6000系列测序仪(IlluminaPE150)完成双端测序。
[0028]1.3生物信息学分析
[0029]原始下机数据进行过滤后得到高质量数据(CleanData)与参考基因组序列进行比对，根据百迈客生物科技有限公司的规范流程完成后续生物信息学分析。结合样本的病理学信息特征进行个性化分析得到与肝癌多结节发生密切相关的驱动基因并进行功能富集。
[0030]2.结果
[0031]2.1质控结果
[0032]共计完成54个样品的外显子组测序(其中40个样品为肿瘤组织，14个样品为癌旁
对照组织)。每个样品平均产生21.86Gb Clean Data，质量值为Q30(错误率小于0.1％)的碱基比例为93.42％。样本的一致性检测(评估肿瘤组织和对照组织是否来自于同一个体)结果如表1所示：除编号为S77
‑
1的样本以外，其余肿瘤组织与癌旁对照组织样本的一致性水平均接近99—100％，认为是一致的，而S77
‑
1与S77
‑
P的一致性仅为41.45％，原因可能是混样或送样有误。Clean Reads的比对结果如表2所示：所有样本的目标区域测序片段均能很好的比对到参考基因组上(比对百分数均达98％以上)，表明该批样本的外显子测序数据质量较好，结果可靠。
[0033]表1样本一致性信息
[0034][0035][0036]注：Tumor_id：肿瘤样品ID；Normal_id：配对的正常样品ID；Concordance(％)：正常和肿瘤样品一致性比例；Tumor Contamination：肿瘤污染比例；Normal Contamination：为正常污染比例。
[0037]表2样品与参考基因组比对信息
[0038][0039][0040][0041]注：ID：样品编号；Total_Reads：Clean Reads数；Ma本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝癌多结节相关驱动基因的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)收集肝癌组织标本及对照癌旁标本；(2)提取样本DNA进行全外显子组测序；(3)生物信息学分析。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：采取Covaris技术将检测合格的DNA样品打断成180
‑
220bp的片段，采用Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome V3/Agilent SureSelect HumanAll Exon V6外显子捕获试剂盒构建文库，经Illumina Nova Seq6000系列测序仪完成双端...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军杰，陈洁，罗涛，
申请(专利权)人：广西医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：