一种表达荧光基因的根瘤菌HH103及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种表达荧光基因的根瘤菌HH103及其构建方法与应用，属于农用微生物的技术领域。为了更快更方便的找到根瘤菌的侵染线。本发明专利技术提供一种表达荧光基因的根瘤菌HH103，所述表达荧光基因的根瘤菌HH103是以根瘤菌HH103为出发菌株，通过真核表达载体在出发菌株中表达荧光基因获得的，所述荧光基因为GFP基因、gus基因和rfp基因。上述表达荧光基因的根瘤菌HH103在制备检测根瘤菌侵染大豆能力的试剂盒中的应用。的试剂盒中的应用。的试剂盒中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种表达荧光基因的根瘤菌HH103及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于农用微生物的
，具体涉及一种表达荧光基因的根瘤菌HH103及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]常规检测根瘤菌的侵染线只能通过光学显微镜在根毛发育早期通过显微镜在镜头下仔细的观察，需要很大的放大倍数，一根根根毛的仔细观察，需要很大的运气和耐心才能找到，侵染线，而通过荧光标记后在视野内是否有荧光的线出现则可以一目了然。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了更快更方便的找到根瘤菌的侵染线。
[0004]本专利技术提供一种表达荧光基因的根瘤菌HH103，所述表达荧光基因的根瘤菌HH103是以根瘤菌HH103为出发菌株，通过真核表达载体在出发菌株中表达荧光基因获得的。
[0005]进一步地限定，所述荧光基因为GFP基因、gus基因和rfp基因。
[0006]进一步地限定，所述GFP基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]进一步地限定，真核表达载体为pSoy10载体。
[0008]本专利技术提供一种上述的表达荧光基因的根瘤菌HH103的构建方法，所述构建方法的步骤如下：通过根瘤菌三亲杂交将含有GFP基因的回补荧光质粒转入根瘤菌HH103中获得的。
[0009]进一步地限定，所述含有GFP基因的回补荧光质粒的构建方法是：利用利用 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA和CTTGTACAGCTCGTCCATGCC序列将GFP基因从 Fu28载体上完成扩增，通过同源重组的方法将nptⅡ启动子与GFP基因克隆至pFAJ1702上，所述nptⅡ启动子的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]本专利技术提供一种检测根瘤菌侵染大豆能力的试剂盒，所述试剂盒含有上述的表达荧光基因的根瘤菌HH103。
[0011]本专利技术提供一种检测根瘤菌侵染线的形成的方法，所述方法的具体步骤如下：选取待检测的大豆毛状根材料，接种上述的表达荧光基因的根瘤菌HH103，通过荧光共聚焦显微镜观测并统计侵染线。
[0012]本专利技术提供上述的表达荧光基因的根瘤菌HH103在制备检测根瘤菌侵染大豆能力的试剂盒中的应用。
[0013]有益效果：常规检测根瘤菌的侵染线只能通过光学显微镜在根毛发育早期通过显微镜在镜头下仔细的观察，需要很大的放大倍数，一根根根毛的仔细观察，需要很大的运气和耐心才能找到，侵染线，而通过荧光标记后在视野内是否有荧光的线出现则可以一目了然。
附图说明
[0014]图1为GmMPK6:3
×
Myc过表达载体构建；A：Fu48 GmMPK6a:3
×
Myc和Fu48 GmMPK6b:3
×
Myc的菌液PCR检测，泳道1为GmMPK6a，泳道2为GmMPK6b；M：Trans 2K Plus DNA marker。B：pSoy10 Ubi:GmMPK6a:3
×
Myc和pSoy10 Ubi:GmMPK6b:3
×
Myc 的菌液PCR检测，泳道1为GmMPK6a，泳道2为GmMPK6b；M：Trans 2K Plus DNA marker。
[0015]图2为GmMPK6s过表达毛状根qRT
‑
PCR检测及免疫印迹分析；A：空载体、pSoy10 Ubi:GmMPK6a:3
×
Myc和pSoy10 Ubi:GmMPK6b:3
×
Myc毛根转化后，目的基因MPK6a和 MPK6b的相对表达量。使用GmUKN1(Glyma.12g020500)作为内参基因，数据为3次生物学重复的均值
±
标准误，Student
’
s t test进行显著性分析，**代表P<0.01，***代表P<0.001。 B：免疫印迹分析阳性根，并使用Actin抗体检测蛋白提取效率。EV代表pSoy10空载、 OE
‑
MPK6a代表pSoy10 Ubi:GmMPK6a:3
×
Myc、OE
‑
MPK6b代表pSoy10 Ubi:GmMPK6b:3
ꢀ×
Myc。
[0016]图3为GmMPK6a和GmMPK6b过表达毛状根结瘤表型；A：pSoy10 Ubi:GmMPK6a:3
ꢀ×
Myc、pSoy10 Ubi:GmMPK6b:3
×
Myc和空载体分别接种HH103以及rhcN突变体的毛状根表型图，EV代表pSoy10空载、OE
‑
MPK6a代表pSoy10 Ubi:GmMPK6a:3
×
Myc、OE
‑
MPK6b 代表pSoy10 Ubi:GmMPK6b:3
×
Myc，比例尺为1cm。B：毛状根转化并过表达GmMPK6 的根瘤表型的箱线图，使用Student
’
s t test进行显著性分析，其中“***”代表P<0.001，“**”代表P<0.01。n＝20。
[0017]图4为GmMPK6a和GmMPK6b基因编辑的结构示意；GmMPK6a和GmMPK6b基因编辑的结构示意图，包含sgRNA的靶序列、PAM位点信息以及MPK6a
‑
Cas
‑
TF(R)和MPK6b
‑
Cas
‑
TF(R)所在位置。
[0018]图5为GmMPK6a和GmMPK6b基因编辑情况检测；A：通过PCR鉴定检测5株基因编辑的大豆毛状根材料的编辑情况。M：DL5000 DNAMarker；0：东农50野生型；1
‑
15基因编辑的毛状根。B：经过测序后，确定的GmMPK6a和GmMPK6b基因编辑位点情况。
[0019]图6为敲除GmMPK6的结瘤表型；A：pSoy10 GmMPK6
‑
Cas9和空载体pSoy10分别接种HH103以及rhcN突变体毛状根表型图，EV：空载体pSoy10；KO：Knockout即pSoy10 GmMPK6
‑
Cas9。比例尺为1cm。B：毛状根转化pSoy10 GmMPK6
‑
Cas9的根瘤表型的箱线图，使用Student
’
s t test进行显著性分析，其中“***”代表P<0.001，“*”代表P<0.05，“ns”代表P＞0.05。n＝15。
[0020]图7为GmMPK6表达模式，A是在根尖里表达；B是GmMPK6a与GmMPK6b在大豆根中的表达模式；
[0021]图8为pFAJ1702 nptⅡ:GFP的PCR检测；pFAJ1702 nptⅡ:GFP的菌液PCR检测M：Trans 2K PlusⅡDNA marker。1：p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达荧光基因的根瘤菌HH103，其特征在于，所述表达荧光基因的根瘤菌HH103是以根瘤菌HH103为出发菌株，通过真核表达载体在出发菌株中表达荧光基因获得的。2.根据权利要求1所述的表达荧光基因的根瘤菌HH103，其特征在于，所述荧光基因为GFP基因、gus基因和rfp基因。3.根据权利要求2所述的表达荧光基因的根瘤菌HH103，其特征在于，所述GFP基因的序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的表达荧光基因的根瘤菌HH103，其特征在于，真核表达载体为pSoy10载体。5.权利要求1
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4任一项所述的表达荧光基因的根瘤菌HH103的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：通过根瘤菌三亲杂交将含有GFP基因的回补荧光质粒转入根瘤菌HH103中获得的。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述含有GFP基因的回补荧光质粒的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛大伟，陈庆山，马超，王锦辉，武小霞，刘春燕，齐照明，赵莹，杨明亮，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：