青虾CathepsinD基因及其dsRNA的应用制造技术

本发明专利技术公开了青虾Cathepsin D基因及其dsRNA的应用，属于生物技术领域。首先获得青虾Cathepsin D基因，其核苷酸全长序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。而后利用RNA干扰等技术获得序列为SEQ ID NO：3基因片段，并以此基因片段为模板合成dsRNA1。将dsRNA1注入雌性青虾围心腔后，在第10、20和30天，dsRNA1组青虾的性腺发育指数分别为1.45％，1.64％和1.79％，均显著低于对照组和dsRNA2组。由此可见，dsRNA1可以有效减缓雌性青虾卵巢发育速度。度。度。

【技术实现步骤摘要】
青虾Cathepsin D基因及其dsRNA的应用


[0001]本专利技术涉及青虾Cathepsin D基因及其dsRNA的应用，属于生物


技术介绍

[0002]青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称为河虾，是中国重要的淡水养殖虾类之一。雌性青虾具有“性快熟”的特点，在进入繁殖季节后，虾苗放养45天左右可以达到性成熟，当年生的雌虾可繁殖多代。特别是在夏季水温较高时期，雌虾一个卵巢成熟周期只需要15天时间。这一特点是多年来一直困扰青虾产业的重要问题。卵巢快速成熟导致青虾繁殖过快，引起多代同堂，继而引发养殖密度过高、缺氧风险显著提高、饲料消耗增大等问题，严重影响了养殖的经济效益，更给家系选育等科研工作造成难题。因此，找到控制青虾卵巢快熟的方法，对于青虾产业健康高效的发展意义重大。
[0003]组织蛋白酶D(Cathepsin D)广泛存在于各种生物体中，属于酸性溶酶体内切蛋白酶，能够水解胞内蛋白和多肽，维持细胞稳态。在人和哺乳动物中，组织蛋白酶D参与激活酶原和生长因子、大脑抗原呈递、表皮分化及细胞凋亡等多种机体生理活动。
[0004]RNAi(RNA interference,RNAi)技术是利用双链RNA在Dicer酶作用下形成众多小的RNA片段，最终引起靶向mRNA发生降解，导致细胞或个体不能合成相应的氨基酸，引起个体功能表现缺失，达到干扰敲除的目的。已有研究证实，对青虾卵黄蛋白原基因进行RNAi，可有效抑制青虾卵巢发育(Bai et al,2015)。证明RNAi技术在解决青虾“性快熟”问题中具有很好的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种青虾Cathepsin D基因、干扰基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用，该基因可用于减缓雌性青虾卵巢发育成熟速度，为解决青虾“性快熟”问题及遗传育种改良提供新的思路。
[0006]技术方案
[0007]本专利技术提供了一种青虾Cathepsin D基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]本专利技术提供了一种青虾组织蛋白酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]本专利技术还提供了所述的青虾的Cathepsin D基因或青虾的组织蛋白酶D作为靶标在抑制青虾卵巢发育或制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。
[0010]本专利技术提供了一种高效的青虾Cathepsin D干扰基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
[0011]本专利技术还提供了扩增所述青虾Cathepsin D干扰基因片段的引物组，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列。
[0012]本专利技术提供的一种青虾Cathepsin D干扰基因片段获取方法如下：对青虾Cathepsin D氨基酸序列分析后，选择Cathepsin D特异性区域，设计了两对干扰引物，一是
上游引物SEQ ID NO：4和下游引物SEQ ID NO：5，二是上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7，然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩增得到DNA片段SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8。
[0013]进一步以DNA片段SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8为模板，利用试剂盒合成dsRNA1、dsRNA2。
[0014]本专利技术还提供了一种用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA，所述dsRNA是以所述青虾Cathepsin D干扰基因片段为模板体外转录获得。
[0015]本专利技术还提供了一种制备用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA的方法，所述方法为，以核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的干扰基因片段为模板转录得到dsRNA。
[0016]本专利技术还提供了所述dsRNA抑制青虾Cathepsin D基因表达的应用。
[0017]本专利技术还提供了所述dsRNA抑制青虾卵巢发育或制备抑制青虾卵巢发育的产品中的应用。
[0018]本专利技术还提供了一种生物抑制剂，含有所述dsRNA。
[0019]在一种实施方式中，所述生物抑制剂还含有载体和/或辅料。
[0020]本专利技术还提供了一种抑制青虾卵巢发育的方法，所述方法为将所述dsRNA或所述生物抑制剂处理青虾。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述处理为将所述dsRNA或所述生物抑制剂导入至青虾体内。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述导入为将所述dsRNA或所述生物抑制剂注射至青虾围心腔内。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述dsRNA或所述生物抑制剂的注射剂量为4μg/g。
[0024]本专利技术还提供了一种抑制青虾卵巢发育的试剂盒，含有所述dsRNA或所述生物抑制剂。
[0025]本专利技术还提供了所述青虾Cathepsin D基因、所述青虾Cathepsin D基因编码的组织蛋白酶D、所述青虾Cathepsin D干扰基因片段、所述dsRNA、所述生物抑制剂或所述试剂盒在青虾养殖方面的应用。
[0026]有益效果：
[0027]1、在注射dsRNA1后第4天与第7天卵巢中的Cathepsin D基因沉默效率分别为98.80％、99.48％，有效的抑制了青虾Cathepsin D基因的表达。
[0028]2、注射dsRNA1可以有效降低青虾Cathepsin D基因mRNA的表达，抑制青虾卵巢发育速度。青虾在第10天，dsRNA1组性腺发育指数为1.45％，显著低于对照组(2.37％)，第20天，dsRNA1组性腺发育指数为1.64％，显著低于对照组(3.19％)，即使到了第30天，dsRNA1组性腺发育指数也仅为1.79％，显著低于对照组(4.57％)和dsRNA2组(3.29％)。
附图说明
[0029]图1.卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，卵巢中Cathepsin D基因在不同采样时间点的mRNA的表达，青虾β
‑
Actin基因作为内参基因。1、4、7分别为注射后第1天、第4天、第7天(n＝9)。不同字母代表p<0.05，对照组用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)基因作为报告基因，对照组注射相同剂量的dsGFP。
[0030]图2.卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，青虾卵巢性腺指
数变化图。1、10、20、30分别为注射后第1天、第10天、第20天、第30天(n＝3)。不同字母a、b代表p<0.05。
具体实施方式
[0031]实施例1：青虾Cathepsin D基因全长序列的获得
[0032]通过对雌性青虾巢各个发育时期进行转录组比较分析，获得全长的差异基因Cat本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.青虾的Cathepsin D基因或组织蛋白酶D作为靶标在抑制青虾卵巢发育或制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用；所述Cathepsin D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述组织蛋白酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种高效的青虾Cathepsin D干扰基因片段，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO：3。3.扩增权利要求2所述青虾Cathepsin D干扰基因片段的引物组，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。4.一种用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA是以权利要求2所述青虾Cathepsin D干扰基因片段为模板体外转录获得。5.一种制备用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA的方法，其特征在于，所述方法为，以以权利要求2所述青虾Cat...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔慧，程丹，傅洪拓，张文宜，蒋速飞，熊贻伟，金舒博，龚永生，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：