一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株及其应用，主要利用豆制品加工废水与柑橘深加工过程中产生的废水作为发酵基质，替代培养基中的碳氮源，采用高产纳豆激酶的生产菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KC

【技术实现步骤摘要】
一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一种制备纳豆激酶菌剂的生产工艺。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性需氧菌，其能够迅速消耗动物体肠道内的游离氧，从而有效提高营养物质的利用效率。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长菌体自身合成α
‑
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体（人体）内的消化酶类一同发挥作用；能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体（人体）内干扰素和巨噬细胞的活性。
[0003]纳豆激酶是一种功能性物质，具有防血栓作用、安全性好、易吸收、药效持久等特点，与常规溶血栓药物相比较，现行市场上使用的溶栓药物其溶栓作用主要并不是直接溶解纤维蛋白，而大部分属于纤溶蛋白酶原激活剂。而纳豆激酶具有多种溶栓机制，不仅表现为纳豆激酶可直接降解纤维蛋白为小肽或氨基酸，同时，纳豆激酶还可以刺激血管内壁，进而产生内源纤维酶原激活剂，通过该激活剂激活纤维蛋白酶，从而达到增加溶栓效果的目的。而且，纳豆激酶还可以激活由肾脏所产生的尿激酶原转变成尿激酶，加大了溶栓效果。另外，纳豆激酶具有溶解纤维酶原激活剂抑制物的作用，由此便可以维持体内纤维酶原激活剂的活性，便于激活体内纤维蛋白酶从而溶解纤维蛋白，达到溶栓作用，纳豆激酶在治疗血栓疾病上具有广阔的研究及应用前景。因此，纳豆激酶是一种新型溶栓药物。目前，纳豆激酶的发酵工艺一般分为两种，分别为固态发酵和液态发酵。固态发酵与液态发酵相比，更易出现易染菌、味道难闻、回收率低、纳豆激酶酶活较低、操作难等问题。液体发酵成本低、污染少、产酶量高、易操作等优势。目前，用于高产纳豆激酶工程菌有大肠杆菌、乳酸菌及酵母菌等，这些工程菌并不能直接用于生产使用中，而本专利技术中的菌株能够自身分泌并高产纳豆激酶，同时，使用豆制品生产过程中的废水和柑橘深加工中的废水作为主要生产原料，既利用了废弃物中的碳氮含量，又避免了液态发酵中副产物嘌呤物质等，同时节约了成本，改善了环境污染。
[0004]因此，本专利技术主要采用液态发酵的方式，将粗原料——豆制品加工废水和柑橘深加工过程中的废水作为发酵培养基，极大程度上降低了生产成本，一定程度上提高了纳豆激酶的酶活，同时对发酵液添加一定保护剂，采用喷雾干燥工艺从而提高纳豆激酶的酶活。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株，通过ARTP诱变筛选高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌，可以利用粗原料——豆制品加工废水与柑橘深加工废水作为发酵基质，既能改善环境，又能提高经济效益。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
一种纳豆激酶的生产菌株，菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC
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20225，已于2022年5月 9 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 24848 。
[0007]所述菌株是通过如下方法筛选得到的：从市面上买来的纳豆激酶类的产品中进行初筛分离出枯草芽孢杆菌，使用基础培养基进行纯化与培养，37℃培养24h，同时测定生物量和纳豆激酶量，获得一株较高的产量的枯草芽孢杆菌，将其命名为perfect
‑
1，作为出发菌株。基础培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L（固态培养基使用）。
[0008]将出发菌株perfect
‑
1接种于基础培养基中培养后，将培养完成的液态培养基按照10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5进行稀释，量取菌液0.1mL均匀涂布于无菌的空平板上，待平板风干后进行N
+
离子束注入，N
+
离子束注入剂量为（90、135、180、225、270）
×
2.6
×
10
13
N+/cm2，N
+
离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1 mL 无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，37 ℃倒置培养1 d，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出菌落生长速度快且纳豆激酶分泌率最高的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC
‑
20225。
[0009]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC
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20225的培养条件为：枯草芽孢杆菌菌种采用好氧培养的方式，用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、柑橘深加工过程产生的废水等材料；用于培养该菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、全豆粉、豆渣、豆制品加工废水等材料。该菌株生长的最佳温度范围为20
‑
40℃，pH范围5
‑
9，最佳pH范围为6
‑
8。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、氯化铁等无机盐类。
[0010]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC
‑
20224的生理形态特征为：枯草芽胞杆菌KC
‑
20225，在基础培养基上生长旺盛，明显观察到单菌落着色比较均匀，芽孢呈椭圆形且菌体不膨大，有鞭毛，颜色呈现为乳白色。菌落的表面呈现粗糙不透明，且污白色。
[0011]所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC
‑
20225在液体发酵生产纳豆激酶中的应用。包括如下步骤：1）种子培养：从活化的平板上取一环菌接入液体种子培养基中，20
‑
40℃培养10～20 h；2）取步骤1）的种子液接入液体培养基中进行发酵培养，接种量为2%~8%，培养温度为20℃~40℃，液体发酵。
[0012]步骤1）中所述液体种子培养基包括如下质量百分比的组分：碳源10～30g/L，氮源15～30g/L，无机盐0～5g/L，其余为水，pH5.5～8.0。其中所述碳源选自是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、柑橘深加工过程产生的废水等材料；用于培养该菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、全豆粉、豆渣、豆制品加工废水等材料。该菌株生长的最佳温度范围为20
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40℃，pH范围5
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9，最佳pH范围为6
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8。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、氯化铁等无机盐类。
[0013]发酵培养基为添加有无机盐的废水培养基，所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株，所述菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KC
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20225，已于2022年5月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.24848。2.权利要求1所述菌株在发酵生产纳豆激酶中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌bs
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20225活化，在25～40℃下好氧发酵10～20h；其中，好氧发酵培养基为添加有无机盐的废水培养基。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的废水为柑橘深加工过程中产生的废水和豆制品加工废水。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述柑橘深加工过程中产生的废水和豆制品加工废水按体积比（20%~80%）：（80%~20%）混合。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的无机盐为镁盐、钾盐、钙盐、磷酸盐中的任意一种或几种...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱平，黄兴江，张晓明，
申请(专利权)人：湖南更好愿景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：