一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用制造技术

本发明专利技术开发一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用。混合物包括两歧双歧杆菌H3

【技术实现步骤摘要】
一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常见的癌症类型之一，其发病率仅次于乳腺癌和肺癌，同结直肠癌也是全球第二大癌症相关死亡原因。多数肠癌与炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)存在密切关系，IBD包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(crohn
’
s disease，CD)，UC主要表现为结肠和直肠黏膜发炎，而克罗恩病则会影响口腔至肛门的任何部位。长期的慢性炎症刺激，可能会导致组织的进一步增生，进而引发肿瘤。结肠炎相关结直肠癌(colitis
‑
associated colorectal cancer，CAC)是其中比较典型的由炎症引发癌症的例子，已经有多项研究证实UC与CAC之间的关系。据报道，溃疡性结肠炎患者在发病30年后，其CRC发病率高达18％，远大于一般人群。目前，炎症与肿瘤的关系已成为深入了解肿瘤发生发展的研究热点。因此，控制疾病活动、维持长时间缓解、预防癌变的发生至关重要。
[0003]益生菌可通过一系列作用机制对结直肠癌起到预防作用，包括改变肠道微生物组成；通过促进癌细胞凋亡以及调节细胞分化抑制肿瘤生长，并通过抑制细胞增殖阻碍肿瘤发展；与腐败和致病微生物竞争，恢复受损的黏膜屏障功能；增强宿主免疫反应，抑制炎症反应等。由于菌株特性不同，不同益生菌菌株及组合对CAC表现出不同程度的缓解作用。研究发现双歧杆菌具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，动物实验表明，大鼠服用双歧杆菌后，结肠癌的癌前病变降低25～30％。嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌的混合物可以调节结直肠癌大鼠微生物菌群组成，通过TLR2信号促进紧密连接蛋白ZO
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1、Occludin的表达，增强肠黏膜上皮屏障完整性，从而减少肿瘤的发生。而关于乳酸乳球菌对CAC的影响研究较少。乳酸乳球菌广泛应用于乳制品发酵，本课题组前期从新疆传统乳制品中分离出一株乳酸乳球菌KLDS4.0325，含有KLDS4.0325的发酵乳具有调节小鼠肠道菌群的作用。我们之前的研究表明两歧双歧杆菌H3
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R2具有恢复小鼠受伤肠粘膜，增加绒毛长度和隐窝深度的能力。因此基于现状，两歧双歧杆菌与乳酸乳球菌混合物用于CAC的缓解具有非常重要的现实意义及应用价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物，通过体外试验及动物试验判断其初步预防及缓解CAC的效果。
[0005]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)菌株的培养：混合菌悬液是将H3
‑
R2与KLDS 4.0325以活菌数1:1比例混合。(2)体外评估两菌及
其混合物对结肠癌HT
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29细胞的增殖抑制及促凋亡作用：通过CCK
‑
8法检测菌株对HT
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29细胞的增殖抑制作用；通过流式细胞仪检测细胞凋亡；通过RT
‑
qPCR检测HT
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29细胞凋亡相关mRNA表达；通过Western blot检测HT
‑
29细胞凋亡相关蛋白表达。(3)利用AOM/DSS诱导的小鼠模型评估受试菌株对CAC的作用效果：使用雄性5周龄C57BL/6J小鼠，饲养温度23
±
2℃，湿度55
±
5％，12h交替光照。将60只小鼠试喂养1周后随机分为6组：正常组(NC)、模型组(MC)、阳性对照组(PC)、两歧双歧杆菌H3
‑
R2组(BH)、乳酸乳球菌KLDS4.0325组(LK)以及H3
‑
R2加KLDS4.0325混菌组(BL)。对不同组小鼠体重、脾脏指数、结肠组织状态、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力、缺氧诱导因子(HIF
‑
1α)、血清及结肠组织中的细胞因子、紧密连接蛋白、Ki67免疫组化以及NLRP3信号通路相关基因mRNA的表达水平进行测定，并对小鼠肠道菌群进行分析。
[0006]所述的两歧双歧杆菌H3
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R2和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0325由实验室自行分离，保藏于东北农业大学乳品科学教育部重点实验室。
[0007]所述的CCK
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8法检测菌株对HT
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29细胞的增殖抑制作用为：目的菌株与HT
‑
29细胞共同孵育6h和12h后，目的菌株对HT
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29细胞表现出不同程度的抑制作用，BL对HT
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29增殖的抑制率显著高于单个菌株处理组。
[0008]所述的流式细胞仪检测HT
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29细胞的凋亡情况。目的菌株单独或混合作用均可促进HT
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29细胞凋亡，H3
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R2与KLDS4.0325混菌作用效果优于单个菌株作用效果。
[0009]所述的RT
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qPCR检测HT
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29细胞凋亡相关mRNA表达结果为：HT
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29细胞经药物5
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FU处理后，Caspase
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3、Caspase
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9、Bax蛋白表达水平显著升高，而Bcl
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2蛋白表达水平显著降低。与正常对照组(NC组)相比，BH组、LK组以及BL组的Caspase
‑
3、Caspase
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9和Bax mRNA相对表达量显著上调，Bal
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2的表达量显著下调。
[0010]所述的Western blot检测HT
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29细胞凋亡相关蛋白表达结果为：BH、LK以及BL处理的Caspase
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3、Caspase
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9和Bax蛋白水平显著高于正常对照组，Bcl
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2蛋白水平显著低于正常对照组，其中BL组调节蛋白表达效果最显著。
[0011]所述的小鼠体重变化为：AOM/DSS处理使得小鼠体重下降，显著低于正常组。两歧双歧杆菌H3
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R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325的单独或联合干预能显著改善AOM/DSS小鼠体重减轻的状况。
[0012]所述的结肠长度及结肠组织状态为：两歧双歧杆菌H3
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R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325单独或联合使用可显著缓解AOM/DSS小鼠结肠缩短的情况。并显著改善AOM/DSS处理导致小鼠结肠上皮结构破坏，炎症细胞浸润，隐窝扭曲等症状。
[0013]所述的小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)菌株的培养：混合菌悬液是将H3
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R2与KLDS 4.0325以活菌数1:1比例混合。(2)体外评估两菌及其混合物对结肠癌HT
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29细胞的增殖抑制及促凋亡作用：通过CCK
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8法检测菌株对HT
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29细胞的增殖抑制作用；通过流式细胞仪检测细胞凋亡；通过RT
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qPCR检测HT
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29细胞凋亡相关mRNA表达；通过Western blot检测HT
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29细胞凋亡相关蛋白表达。(3)利用AOM/DSS诱导的小鼠模型评估受试菌株对CAC的作用效果：使用雄性5周龄C57BL/6J小鼠，饲养温度23
±
2℃，湿度55
±
5％，12h交替光照。将60只小鼠试喂养1周后随机分为6组：正常组(NC)、模型组(MC)、阳性对照组(PC)、两歧双歧杆菌H3
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R2组(BH)、乳酸乳球菌KLDS4.0325组(LK)以及H3
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R2加KLDS4.0325混菌组(BL)。对不同组小鼠体重、脾脏指数、结肠组织状态、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力、缺氧诱导因子(HIF
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1α)、血清及结肠组织中的细胞因子、紧密连接蛋白、Ki67免疫组化以及NLRP3信号通路相关基因mRNA的表达水平进行测定，并对小鼠肠道菌群进行分析。2.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的两歧双歧杆菌H3
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R2和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS 4.0325由实验室自行分离，保藏于东北农业大学乳品科学教育部重点实验室。3.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的Western blot检测HT
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29细胞凋亡相关蛋白表达结果为：BH、LK以及BL处理的Caspase
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3、Caspase
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9和Bax蛋白水平显著高于正常对照组，Bcl
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2蛋白水平显著低于正常对照组，其中BL组调节蛋白表达效果最显著。4.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的结肠长度及结肠组织状态为：从盲肠至近肛门处的长度，NC组平均结肠长度为7.9
±
0.29cm，MC组平均结肠长度为5.83
±
0.28cm；与NC组和PC组相比，BH、LK以及BL组的小鼠结肠均有不同程度缩短，但仍显著高于模型组；AOM/DSS处理导致小鼠结肠上皮结构破坏，炎症细胞大量浸润，杯状细胞大量减少，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥晨，刘利军，尚佳萃，陈禹含，杨硕，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：