一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：S1、制备第一级催化发夹自组装反应体系(CHA)；S2、制备第二级杂交链式反应体系(HCR)；S3、荧光标记杂交链式反应中HP3链；S4、形成荧光传感器。该基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，通过HP2通过toehold3将Trigger链置换出来，形成稳定的HP1

【技术实现步骤摘要】
一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体为一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.p)是一种革兰氏阴性菌，定植于全球一半以上人口的胃黏膜中，其传染力强，可通过粪－口、口－口、胃－口及医疗器具操作等传播。幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病密切相关，感染呈世界性分布，已被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌因子，幽门螺杆菌的早诊断早治疗可以有效减少不良预后的发生率。幽门螺杆菌的临床检测方法分为侵入性和非侵入性。侵入性检测方法包括快速尿素酶试验、组织病理活检、菌体分离培养等；非侵入检查主要包括同位素标记的尿素呼气试验、血清幽门螺杆菌抗体、粪便幽门螺杆菌抗原检测、分子生物学(如PCR)检测等。与侵入式检测方法比较，非侵入检查具有快速、易操作和便于重复检测等优点，适合幽门螺杆菌的流行病学筛查。其中，尿素
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C呼气实验被认为是除细菌培养外诊断幽门螺杆菌感染的金标准，但是该方法有一定放射性，孕妇、哺乳期妇女及12岁以下儿童不宜采用，且检测结果易受药物及上消化道出血等因素的影响，易出现假阴性。因此，急需建立一种灵敏、快速、便捷、普适的检测技术，用于幽门螺杆菌感染的快速准确筛查，为幽门螺杆菌的早诊断早治疗提供技术支撑。
[0003]目前文献报道在胃组织、胃液、粪便、牙菌斑等样本中均可检出幽门螺杆菌，血清中也存在幽门螺杆菌抗体。其中胃组织和胃液中幽门螺杆菌含量相对较高，但部分病人难以接受胃镜取样；而粪便标本易于获取，可作为幽门螺杆菌检测的潜在对象，但是由于粪便基质复杂且其浓度较低，常规检测方法难以达到检测的特异性和灵敏度要求。
[0004]生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为光、电等可检测信号的仪器，它由识别元件、换能器和信号放大装置三部分组成。生物传感器具有灵敏度高、选择性好、实时检测等优点，在生命科学领域得到了发展和广泛应用。随着适配体的出现，基于DNA的生物传感器不仅可用于检测核酸，也可用于蛋白质、细菌、病毒的等其他生物标志物的检测。同时，为了达到痕量检测的要求，各种核酸放大策略被提出来，如聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。PCR灵敏度高，但扩增过程需要精确控制温度，所以难以用于现场快速检测。LAMP的引物设计较为复杂，限制其广泛的应用。近年来，新出现的等温无酶扩增技术，包括催化发夹组装(CHA)和杂交链式反应(HCR)，具有操作简单，不需要酶催化作用，且信号放大效率高等优点，被广泛的用于传感器的构建。但是由于粪便样本基质复杂且幽门螺杆菌的丰度低，单一信号放大策略难以满足检测要求，多重信号放大策略的联用是未来研究的趋势。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术为一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，目前文献报道在胃组织、胃液、粪便、牙菌斑等样本中均可检出幽门螺杆菌，血清中也存在幽门螺杆菌抗体。其中胃组织和胃液中幽门螺杆菌含量相对较高，但部分病人难以接受胃镜取样；而粪便标本易于获取，可作为幽门螺杆菌检测的潜在对象，但是由于粪便基质复杂且其浓度较低，常规检测方法难以达到检测的特异性和灵敏度要求。
[0006]本专利技术的技术方案是：一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1、制备第一级催化发夹自组装反应体系(CHA)；
[0008]S2、制备第二级杂交链式反应体系(HCR)；
[0009]S3、荧光标记杂交链式反应中HP3链；
[0010]S4、形成荧光传感器。
[0011]在进一步的技术方案中，所述S1当中的第一级催化发夹自组装反应由以下步骤制备而成：Trigger链、HP1链和HP2链混合，其中Trigger链、HP1和HP2链的浓度比为1
‑
2:1:1。
[0012]在进一步的技术方案中，所述S2当中的第二级杂交链式反应由以下步骤制备而成：所述S1当中的反应产物、HP3链和HP4链混合，其中HP3链和HP4链的浓度比为1:1～2:1。
[0013]在进一步的技术方案中，所述S3中，HP3链的臂部标记荧光基团和猝灭基团。
[0014]在进一步的技术方案中，所述S3当中形成荧光传感器为：幽门螺杆菌的核酸适配体链Aptamer、Trigger链、HP1链、HP2链、HP3链和HP4链在selection buffer中形成荧光传感器。
[0015]在进一步的技术方案中，一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，所述幽门螺杆菌的核酸适配体DNA sequences(5
’‑3’
)；
[0016]Trigger链的基因序列为：
[0017]GTAGCTGGATCTCGTCGATACACG；
[0018]HP1链的基因序列为：
[0019]CGTGTATCGACGAGATCCAGCTACTACACCAACGACGCTGGATCTCGTCGAGCCGAAAC；
[0020]HP2链的基因序列为：
[0021]ATCCAGCGTCGTTGGTGTAGTAGCTGGATCTCGTCGACTACACCAACGACG；
[0022]HP3链的基因序列为：
[0023]GCCG/Cy3/AAACGAGTCACTGTTT/BHQ2/CGGCTCGACGAG；
[0024]HP4链的基因序列为：
[0025]AGTGACTCGTTTCGGCCTCGTCGAGCCGAAAC。
[0026]在进一步的技术方案中，一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器，该荧光传感器由上述的方法制备而成。
[0027]在进一步的技术方案中，一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光适配体传感器检测幽门螺杆菌的方法，该方法将上述方法制备的荧光适配体传感器用于检测幽门螺杆菌菌体。
[0028]在进一步的技术方案中，在本申请的一个或多个具体的实施方式中，该方法包括以下步骤：
[0029]首先、根据上述的方法制备基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器；
[0030]接着、将不同浓度的幽门螺杆菌各自在S4的荧光传感器中反应，分别测试荧光传感器的荧光强度，构建标准曲线，得到线性方程；
[0031]最后、将待测幽门螺杆菌菌体的样液在S4制备的荧光传感器中反应，采用荧光光谱仪测定其荧光发射光谱，根据标准曲线或者线性方程，计算幽门螺杆菌的含量，判断是否含有幽门螺杆菌。
[0032]本专利技术的有益效果是：
[0033]基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光适配体传感器检测幽门螺杆菌菌体的原理如图1，发夹结构的打开可作为催化发夹自组装和杂交链式反应的驱动力，在T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备第一级催化发夹自组装反应体系(CHA)；S2、制备第二级杂交链式反应体系(HCR)；S3、荧光标记杂交链式反应中HP3链；S4、形成荧光传感器。2.根据权利要求1所述的一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，其特征在于：所述S1当中的第一级催化发夹自组装反应由以下步骤制备而成：Trigger链、HP1链和HP2链混合，其中Trigger链、HP1和HP2链的浓度比为1
‑
2:1:1。3.根据权利要求1所述的一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，其特征在于：所述S2当中的第二级杂交链式反应由以下步骤制备而成：所述S1当中的反应产物、HP3链和HP4链混合，其中HP3链和HP4链的浓度比为1:1～2:1。4.根据权利要求1所述的一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，其特征在于：所述S3中，HP3链的臂部标记荧光基团和猝灭基团。5.根据权利要求 1—4任一所述的一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，其特征在于：所述S3当中形成荧光传感器为：幽门螺杆菌的核酸适配体链Aptamer、Trigger链、HP1链、HP2链、HP3链和HP4链在selection buffer中形成荧光传感器。6.根据权利要求 1—5任一所述的一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，其特征在于：幽门螺杆菌的核酸适配体DNA sequences(5
’‑3’
)；Trig...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹海民，周琛，王东生，王秋菊，谢尧琪，贺巧，罗皓，杨杰，
申请(专利权)人：四川省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：