一种检测两种硝基呋喃代谢物的聚集诱导发光免疫层析试剂盒及应用制造技术

一种检测两种硝基呋喃代谢物的聚集诱导发光免疫层析试剂盒及应用，所述试剂盒包括免疫层析试纸条和聚集诱导发光荧光探针，所述免疫层析试纸条包括聚氯乙烯底板，在聚氯乙烯底板上表面设置有硝酸纤维素膜、吸水垫和样品垫，在硝酸纤维素膜上表面靠近样品垫一侧依次设有检测线T1、检测线T2和质控线C；所述聚集诱导发光荧光探针包括BTPETD制备的绿色聚集诱导发光荧光微球探针和TPB制备的红色聚集诱导发光荧光微球探针。优点是：使用方便，操作简单。用于对呋喃它酮代谢物和呋喃妥因代谢物两种代谢物的同时定性和定量检测，大大提高检测效率，又可以有效提高检测灵敏度。又可以有效提高检测灵敏度。又可以有效提高检测灵敏度。

An aggregation induced luminescence immunochromatographic kit for detecting two nitrofuran metabolites and its application

【技术实现步骤摘要】
一种检测两种硝基呋喃代谢物的聚集诱导发光免疫层析试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于抗生素检测
，涉及一种检测两种硝基呋喃代谢物的聚集诱导发光免疫层析试剂盒及应用，特别涉及一种以聚集诱导发光荧光微球为标记载体制备的荧光免疫层析试纸条，用于水产品中呋喃它酮代谢物(AMOZ)和呋喃妥因代谢物(AHD)的同时检测。

技术介绍

[0002]硝基呋喃类药物因价格低廉且效果好，曾被广泛应用于畜禽及水产养殖业，用于治疗胃肠道感染和预防病变引起的微生物感染等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌性和致突变性等副作用，包括我国在内的许多国家在动物食品生产中早已禁止使用。硝基呋喃类药物进入动物体内代谢迅速，在食品分析中主要检测硝基呋喃类代谢物。呋喃它酮和呋喃妥因是两种较为常见的硝基呋喃类药物。由于这两种药物代谢物残留超标事件仍时有发生，因此对其残留的检测具有重要意义。目前该类药物的检测方法主要是仪器法，然而仪器法所需仪器昂贵，操作复杂，检测周期长，不能满足对大量样品快速筛查的需求。此外，硝基呋喃类药物属于违禁药物且其残留量通常较低，因此对检测方法的灵敏度要求较高。
[0003]免疫层析技术是一种将色谱法与免疫学反应相结合的快速检测技术。该技术不需要昂贵的仪器设备、操作简单、检测成本低、速度快、适用于现场快速检测。在免疫层析技术中，标记材料的选择是决定方法灵敏的重要因素之一。标记抗原或抗体所用材料的性能和信号强度决定了检测结果的读取模式及灵敏度。传统方法多采用胶体金为标记物构建免疫层析试纸条，然而胶体金标记法通常是根据胶体金颜色的深浅读取检测信号进而判别检测结果。因此该方法易受到背景信号的干扰。近年来，有研究利用如荧光染料、量子点、上转换发光材料等荧光材料为标记物构建免疫层析试纸条以降低背景信号干扰。CN113156112A公开了一种同时检测四种硝基呋喃类代谢物的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法和应用，该方法以量子点荧光微球标记抗体构建用于检测硝基呋喃类药物代谢物的荧光免疫层析试纸条，该试剂盒所用标记物在聚集的情况下会发生荧光猝灭，即聚集诱导猝灭效应，当待检目标物浓度较低的情况下，这种聚集诱导猝灭类荧光材料标记手段仍限制免疫层析试纸条的检测，影响检测精确度和灵敏度。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测两种硝基呋喃代谢物的聚集诱导发光免疫层析试剂盒及应用，该试剂盒在检测过程中具有绿色和红色两种荧光信号，分别指示呋喃它酮代谢物和呋喃妥因代谢物的检测结果，可以应用于对样品中这两种代谢物的同时检测，检测结果准确可靠，灵敏度高。
[0005]本专利技术的技术方案是：
[0006]一种检测两种硝基呋喃代谢物的聚集诱导发光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括免疫层析试纸条和聚集诱导发光荧光探针，所述免疫层析试纸条包括聚氯乙烯底板，在聚氯乙烯底板上表面设置有硝酸纤维素膜，在聚氯乙烯底板上表面分别设置有搭接在硝酸纤维素膜左右两侧的吸水垫和样品垫，在硝酸纤维素膜上表面靠近样品垫一侧依次设有检测线T1、检测线T2和质控线C；其特殊之处在于：
[0007]所述检测条T1、检测线T2和质控线C分别是使用划膜仪以1μL/cm的速率将2
‑
NP
‑
AMOZ
‑
BSA包被抗原、2
‑
NP
‑
AHD
‑
BSA包被抗原和山羊抗鼠IgG分别喷涂在硝酸纤维素膜上获得的；
[0008]所述聚集诱导发光荧光探针包括绿色聚集诱导发光荧光微球探针和红色聚集诱导发光荧光微球探针，其具体步骤如下：
[0009](1)绿色聚集诱导发光荧光微球探针的制备
[0010]①
绿色聚集诱导发光荧光微球的制备
[0011]将200μL的1mg/mL 4,7
‑
双[4
‑
(1,2,2
‑
三苯基乙烯基)苯基]苯并
‑
2,1,3
‑
噻二唑(BTPETD)和50μL的2mg/mL聚苯乙烯
‑
马来酸酐(PSMA)混合，并用四氢呋喃定容至1mL，得到混合溶液A；
[0012]在超声条件下，将混合溶液A注入10mL去离子水中，然后室温下超声作用2min～10min后，置于75℃水浴中，氮气吹扫至残余液体为5mL；将残余液体冷却至室温，使用0.22μm的硝酸纤维素膜过滤器过滤，收集滤液，得到绿色聚集诱导发光微球分散液；
[0013]②
绿色聚集诱导发光荧光微球探针的制备
[0014]量取1mL制备的绿色聚集诱导发光溶液、10μL的1mg/mL呋喃它酮衍生化代谢物(2
‑
NP
‑
AMOZ)抗体溶液和60μL的5mg/mL EDC溶液混合均匀，室温条件下避光反应4h；
[0015]反应完成后，利用100KDa超滤离心管以4000rpm/min离心5min，收集内套管残余液体，得到绿色聚集诱导发光荧光微球探针；
[0016](2)红色聚集诱导发光荧光微球探针的制备
[0017]①
红色聚集诱导发光荧光微球的制备
[0018]将100μL的1mg/mL N,N'
‑
(苯并[c][1,2,5]噻二唑
‑
4,7
‑
二乙基双(4,1
‑
苯))双(N
‑
(4
‑
(1,2,2
‑
三苯基乙烯基)苯基)菲
‑1‑
胺(TPB)和50μL的2mg/mL PSMA混合，并用四氢呋喃定容至1mL，得到混合溶液B；
[0019]在超声条件下，将混合溶液B注入10mL去离子水中，然后室温下超声作用20min～30min后，置于75℃水浴，氮气吹扫至残余液体为5mL；将残余液体冷却至室温，使用0.22μm的硝酸纤维素膜过滤器过滤，收集滤液，得到红色聚集诱导发光微球分散液；
[0020]②
红色聚集诱导发光荧光微球探针的制备
[0021]量取1mL制备的红色聚集诱导发光溶液、18μL的1mg/mL呋喃妥因衍生化代谢物(2
‑
NP
‑
AHD)抗体溶液和30μL的5mg/mL EDC溶液混合均匀，室温条件下避光反应4h；反应完成后，利用100KDa超滤离心管以4000rpm/min离心5min，收集内套管残余液体，得到红色聚集诱导发光荧光微球探针。
[0022]进一步的，所述2
‑
NP
‑
AMOZ
‑
BSA包被抗原的浓度是0.15mg/mL，所述2
‑
NP
‑
AHD
‑
BSA包被抗原的浓度是0.5mg/mL，所述山羊抗鼠IgG的浓度是0.1mg/mL。
[0023]进一步的，使用试剂盒检测时，将300μL待测样品溶液或空白对照溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测两种硝基呋喃代谢物的聚集诱导发光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括免疫层析试纸条和聚集诱导发光荧光探针，所述免疫层析试纸条包括聚氯乙烯底板，在聚氯乙烯底板上表面设置有硝酸纤维素膜，在聚氯乙烯底板上表面分别设置有搭接在硝酸纤维素膜左右两侧的吸水垫和样品垫，在硝酸纤维素膜上表面靠近样品垫一侧依次设有检测线T1、检测线T2和质控线C；其特征是：所述检测条T1、检测线T2和质控线C分别是使用划膜仪以1μL/cm的速率将2
‑
NP
‑
AMOZ
‑
BSA包被抗原、2
‑
NP
‑
AHD
‑
BSA包被抗原和山羊抗鼠IgG分别喷涂在硝酸纤维素膜上获得的；所述聚集诱导发光荧光探针包括绿色聚集诱导发光荧光微球探针和红色聚集诱导发光荧光微球探针，其具体步骤如下：(1)绿色聚集诱导发光荧光微球探针的制备
①
绿色聚集诱导发光荧光微球的制备将200μL的1mg/mL 4,7
‑
双[4
‑
(1,2,2
‑
三苯基乙烯基)苯基]苯并
‑
2,1,3
‑
噻二唑(BTPETD)和50μL的2mg/mL聚苯乙烯
‑
马来酸酐(PSMA)混合，并用四氢呋喃定容至1mL，得到混合溶液A；在超声条件下，将混合溶液A注入10mL去离子水中，然后室温下超声作用2min～10min后，置于75℃水浴中，氮气吹扫至残余液体为5mL；将残余液体冷却至室温，使用0.22μm的硝酸纤维素膜过滤器过滤，收集滤液，得到绿色聚集诱导发光微球分散液；
②
绿色聚集诱导发光荧光微球探针的制备量取1mL制备的绿色聚集诱导发光溶液、10μL的1mg/mL呋喃它酮衍生化代谢物(2
‑
NP
‑
AMOZ)抗体溶液和60μL的5mg/mL EDC溶液混合均匀，室温条件下避光反应4h；反应完成后，利用100KDa超滤离心管以4000rpm/min离心5min，收集内套管残余液体，得到绿色聚集诱导发光荧光微球探针；(2)红色聚集诱导发光荧光微球探针的制备
①
红色聚集诱导发光荧光微球的制备将100μL的1mg/mL N,N'
‑
(苯并[c][1,2,5]噻二唑
‑
4,7
‑
二乙基双(4,1
‑
苯))双(N
‑
(4
‑
(1,2,2
‑
三苯基乙烯基)苯基)菲
‑1‑
胺(TPB)和50μL的2mg/mL PSMA混合，并用四氢呋喃定容至1mL，得到混合溶液B；在超声条件下，将混合溶液B注入10mL去离子水中，然后室温下超声作用20min～30min后，置于75℃水浴，氮气吹扫至残余液体为5mL；将残余液体冷却至室温，使用0.22μm的硝酸纤维素膜过滤器过滤，收集滤液，得到红色聚集诱导发光微球分散液；
②
红色聚集诱导发光荧光微球...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀英，夏菲，范玲，朱力杰，励建荣，李学鹏，张少恩，郭晓华，高雪，程媛媛，
申请(专利权)人：渤海大学，
类型：发明
国别省市：