基于FRET核酸适配体传感器高灵敏检测环丙沙星CIP的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于FRET核酸适配体传感器高灵敏检测环丙沙星CIP的方法，属于生物化学技术领域。该核酸适配体传感器中包括TAMRA

【技术实现步骤摘要】
基于FRET核酸适配体传感器高灵敏检测环丙沙星CIP的方法


[0001]本专利技术属于生物化学、分子生物学和分析化学
，涉及一种核酸适配体传感器检测氟喹诺酮类抗生素的方法，具体涉及一种基于FRET核酸适配体传感器高灵敏检测环丙沙星CIP的方法。

技术介绍

[0002]喹诺酮类抗生素是一种人畜共用的抗生素，目前已经发展到第四代，但是目前使用最多的任是第三代喹诺酮类抗生素，即氟喹诺酮类抗生素(Fluoroquinolones，FQs)。环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)具有强大的抗菌效果，在动物饲养、水产养殖和临床上的应用十分广泛。CIP因其分子结构较稳定，所以其生物降解性差。大部分CIP不会被摄用生物直接代谢，而是通过粪便、尿液等排泄途径排放到生态环境中。这些未经过处理的牲畜排泄物将抗菌药物释放到土壤、水体环境当中，给生态系统和人体健康造成了极大的威胁。
[0003]当今，国内外检测FQs的方法包括高效液相色谱法、免疫分析法、微生物抑制法等。但是这些方法具有对检测样品处理要求高、对试剂的选择性高、对仪器依赖性强、不适合大批样品、灵敏度低等特点。对此，许多国家规定了CIP的最高残留量。我国及欧盟等国家和组织纷纷将环丙沙星列入限制使用的兽药名单，并规定了最大残留限量(MRLs)，且规定了动物源性食品(包括牛/羊奶及水产品等)中CIP的MRLs为100μg/kg(约0.302μM)。因此，基于CIP抗生素对人体健康的危害以及对生态环境的影响，开发一种灵敏度高、特异性强、操作简单的检测方法对检测CIP抗生素具有重要意义。
[0004]虽然Investigation of a Truncated Aptamer for Ofloxacin Detection Using a Rapid FRET
‑
Based Apta
‑
Assay[J].Antibiotics，2020，9(12)：860.公开了一种核酸适配体传感器用于检测氧氟沙星，但其核酸适配体中标记了荧光基团FAM，且互补cDNA标记了猝灭基团TAMRA，加入100μM OFL仅使该体系的FAM的荧光恢复40％左右，灵敏度不够高；而且CN 113430204 A公开了一种特异性检测环丙沙星的裂开型核酸适配体及其应用，研究发现荧光基团FAM会被CIP猝灭，从而使得样品中痕量CIP检测受限。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于FRET核酸适配体传感器高灵敏检测环丙沙星CIP的方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种用于检测环丙沙星CIP的核酸适配体传感器，包括TAMRA标记的CIP核酸适配体与FAM标记的互补链cDNA，TAMRA标记的CIP核酸适配体是在SEQ ID NO.1所示序列的3
′
端修饰有猝灭基团TAMRA；FAM标记的互补链cDNA是在SEQ ID NO.2所示序列的5
′
端修饰有荧光基团FAM。
[0008]TAMRA标记的CIP核酸适配体，在本申请中，记作TAMRA
‑
适配体；
[0009]FAM标记的互补链cDNA，在本申请中，记作FAM
‑
cDNA；
[0010]TAMRA
‑
适配体核苷酸序列：
[0011]5′‑
ATA CCA GCT TAT TCA ATT GCA GGG TAT CTG AGG CTT GAT CTA CTA AAT GTC GTG GGG CAT TGC TAT TGG CGT TGA TAC GTA CAA TCG TAA TCA GTT AG
‑
TAMRA
‑3′
；
[0012]18mer的FAM
‑
cDNA核酸序列：
[0013]5′‑
FAM
‑
CTAACTGATTACGATTGT
‑3′
。
[0014]基于FRET核酸适配体传感器高灵敏检测环丙沙星CIP的方法，具体包括以下步骤：
[0015]1)TAMRA
‑
适配体与FAM
‑
cDNA结合形成TAMRA
‑
适配体/FAM
‑
cDNA复合体，基于TAMRA和FAM之间的FRET效应，TAMRA能够猝灭FAM的荧光；
[0016]2)将待测样品加入到步骤1)中的混合物，静置反应，当待测样品中存在靶物质CIP时，发生亲和力竞争，CIP优先与TAMRA
‑
适配体结合形成TAMRA
‑
适配体/CIP复合体，解开TAMRA
‑
适配体/FAM
‑
cDNA的碱基对，通过FAM
‑
cDNA的释放而FAM恢复荧光；
[0017]3)建立CIP浓度与荧光恢复之间的线性回归方程，根据荧光的恢复程度，测定待测样品中CIP的浓度。
[0018]进一步的，步骤1)中，TAMRA
‑
适配体和FAM
‑
cDNA在Tris
‑
HCl缓冲溶液中结合。
[0019]进一步的，步骤1)中，TAMRA
‑
适配体和FAM
‑
cDNA的摩尔比为2∶1；TAMRA
‑
适配体的浓度为75nM。
[0020]进一步的，Tris
‑
HCl缓冲溶液中含1mM Mg
2+
和2mM K
+
；Tris
‑
HCl缓冲溶液的浓度为10mM，pH＝7.4。
[0021]进一步的，步骤2)中，反应温度为室温，反应时间为1h。
[0022]进一步的，CIP的检测范围为0
‑
50.0μM，检出限低于0.01μM，线性检测范围为0.01
‑
1.0μM，线性回归方程为y＝0.22535x+0.01367。
[0023]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0024]1)本专利技术为了避免荧光基团FAM被环丙沙星猝灭，将猝灭基团TAMRA和荧光基团FAM分别标记在cDNA和核酸适配体，选定的猝灭剂TAMRA
‑
适配体和荧光基团FAM
‑
cDNA组合，基于TAMRA和FAM之间的FRET效应，能够有效检测目标物CIP；
[0025]2)本专利技术的目标物CIP对荧光基团FAM的荧光强度具有猝灭作用：在1μM浓度的CIP分别与FAM
‑
适配体/TAMRA
‑
cDNA(常规标记方法)和TAMRA
‑
适配体/FAM
‑
cDNA(本专利技术体系标记方法)进行反应，结果发现本专利技术体系标记方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于FRET核酸适配体传感器高灵敏检测环丙沙星CIP的方法，其特征在于，所述核酸适配体传感器包括TAMRA
‑
适配体与FAM
‑
cDNA，所述TAMRA
‑
适配体是在CIP核酸适配体的3
′
端修饰有猝灭基团TAMRA；所述FAM
‑
cDNA是在CIP核酸适配体的互补链cDNA的5
′
端修饰有荧光基团FAM；所述CIP核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CIP核酸适配体的互补链cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；具体包括以下步骤：1)TAMRA
‑
适配体与FAM
‑
cDNA结合形成TAMRA
‑
适配体/FAM
‑
cDNA复合体，基于TAMRA和FAM之间的FRET效应，TAMRA能够猝灭FAM的荧光；2)将待测样品加入到步骤1)中的混合物，静置反应，当待测样品中存在靶物质CIP时，发生亲和力竞争，CIP优先与TAMRA
‑
适配体结合形成TAMRA
‑
适配体/CIP复合体，解开TAMRA
‑
适配体/FAM
‑
cDNA的碱基对，通过FAM
‑
cDNA的释放而FAM恢复荧光；3)建立CIP浓度与荧光恢复之间的线性回归方程，根据荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：李胎花，李滨汐，王婷，王安琪，王雪，钱美汝，金龙，李威，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：