本申请公开一种用于植物的冷冻切片方法，改进了固定液的配方，以及优化了包埋之前的处理，使得植物细胞在冷冻过程产生的冰晶减少，降低了冷冻过程对细胞造成的损伤，提高了植物组织切片的完整性。本申请还公开一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，重点对抗原修复条件、抗体稀释度、孵育时间、洗涤方式以及抗体稀释液的选择进行优化，系统地建立了检测植物体内植物生长物质分布的免疫荧光定位方法，提高了植物体内植物生长物质免疫荧光定位的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少。的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少。的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少。
【技术实现步骤摘要】
植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法及冷冻切片方法
[0001]本申请涉及植物生理学领域，尤其涉及一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法及冷冻切片方法。
技术介绍
[0002]目前，冷冻切片技术在动物和人体研究中已有着成熟的冰冻切片条件，成为病理学以及临床医学等方面用来研究和观察组织的形态结构变化的主要手段，但由于植物细胞有中央大液泡，含水量较大，具有细胞壁，以及同一植物不同组织部位质地差异也较大，与动物样品相比更容易在冰冻过程中形成冰晶，挤压周围的细胞器，进而损伤植物细胞的细微结构，对植物组织细胞的观察产生影响。
技术实现思路
[0003]本申请的目的是，为克服现有技术的不足，提出一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，以及适应该定位方法的用于植物的冷冻切片方法。
[0004]为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
[0005]第一方面，本申请提供一种用于植物的冷冻切片方法，其包括如下步骤：
[0006]从植物体上选取任一植物器官的组织；
[0007]利用含EDC的固定液进行植物组织的固定；
[0008]利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织；
[0009]利用OTC包埋剂包埋所述浸洗后的植物组织；
[0010]利用冷冻切片机制备5～40μm厚的植物组织切片。
[0011]可选择地，所述植物器官包括：花、叶、茎、茎尖、根或根尖。
[0012]具体地，所述植物组织来源于花、叶、茎尖或根尖时，所制备的植物组织切片的厚度不超过20μm；所述植物组织来源于茎或根时，所制备的植物组织切片的厚度不超过40μm。
[0013]进一步地，所述固定液包括：2％EDC、3％多聚甲醇、0.5％戊二醇、4％蔗糖、10mmol/L磷酸缓冲液，pH＝7.0。
[0014]更进一步地，所述利用含EDC的固定液进行植物组织的固定，包括：在4℃的条件下，利用所述含EDC的固定液浸泡植物组织。
[0015]可选择地，所述利用所述含EDC的固定液浸泡植物组织，包括：所述植物组织离体后投入所述含EDC的固定液进行冰浴抽气固定0.5～1.5h，更换新鲜的所述含EDC的固定液之后在4℃的条件下浸泡4～5h。
[0016]进一步地，所述利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织，包括：配制含4％蔗糖的10mmol/L磷酸缓冲液，调整pH至7.0；浸洗固定后的植物组织1～2h。
[0017]优选地，所述利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织之前，将所述固定后的植物组织切割至毫米尺寸。
[0018]更进一步地，所述利用OTC包埋剂包埋所述浸洗后的植物组织，包括：
[0019]利用可剥离容器容置外裹所述OTC包埋剂的植物组织；
[0020]利用液氮浇注所述可剥离容器至整体固化成包埋块；
[0021]将所述包埋块移入冷冻切片机的内腔至所述包埋块温度平衡；
[0022]剥离所述可剥离容器之后将所述包埋块固定在所述冷冻切片机的样品托上。
[0023]可选择地，所述可剥离容器包括纸盒、薄膜盒中的任意一种。
[0024]可选择地，所述液氮浇注的时间为15～30s。
[0025]进一步可选择地，所述包埋块固定在所述冷冻切片机的样品托上之前，包括：将所述包埋块置于室温使表面软化，用所述OTC包埋剂粘结所述包埋块和样品托。
[0026]进一步地，利用经0.01％多聚赖氨酸处理过的载玻片承载所述植物组织切片。
[0027]更进一步地，所述植物组织切片在37℃的条件下烘干，用于保存或进行后续的处理。
[0028]第二方面，本申请提供一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，其包括如下步骤：
[0029]制备任一植物器官的植物组织切片；
[0030]基于链霉亲和素对所述植物组织切片中的植物生长物质进行免疫荧光染色；
[0031]其中，所述植物组织切片采用如前所述的用于植物的冷冻切片方法获得。
[0032]可选择地，所述植物包括豆科植物。
[0033]进一步可选择地，所述植物包括花生，所述植物器官包括花生的叶、根、近叶段茎和近根段茎。
[0034]进一步可选择地，所述植物生长物质包括脱落酸或脱落酸衍生物。
[0035]进一步地，所述进行免疫荧光染色，包括：
[0036]对植物组织切片进行抗原修复；
[0037]分别利用所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体对所述植物组织切片进行孵育；
[0038]对孵育后的植物组织切片进行显色之后，观察并记录结果。
[0039]可选择地，所述对植物组织切片进行抗原修复，包括以下任意一种方式：
[0040]1mol/L盐酸室温处理20min；
[0041]0.1％的胰蛋白酶37℃处理10min；
[0042]微波修复10min；
[0043]直接加热煮沸20min。
[0044]进一步地，所述分别利用所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体对所述植物组织切片进行孵育，包括：
[0045]分别确认所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体的稀释倍数；
[0046]分别确认所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体的孵育温度和孵育时间；
[0047]确认每次孵育之后对植物组织切片的洗涤方式。
[0048]与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
[0049](1)本申请的用于植物的冷冻切片方法，改进了固定液的配方，以及优化了包埋之
前的处理，使得植物细胞在冷冻过程产生的冰晶减少，降低了冷冻过程对细胞造成的损伤，提高了植物组织切片的完整性。
[0050](2)本申请的用于植物的冷冻切片方法，与石蜡切片、树脂切片相比较，制片时间短，不仅切片的结构完整性高，切片内的活性物质损失少。
[0051](3)本申请的用于植物冷冻切片方法，适用于植物大部分的器官组织，还可以根据器官组织的含水量和软硬程度调整切片前的处理方式和切片的厚度，使得不同器官的植物组织切片有适宜的切片参数。
[0052](4)本申请的植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，采用了冷冻切片技术最大程度地保留了植物组织切片内的活性物质，有利于对易失活的物质进行组织内的免疫定位。
[0053](5)本申请的植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，重点对抗原修复条件、抗体稀释度、孵育时间、洗涤方式以及抗体稀释液的选择进行优化，系统地建立了检测植物体内植物生长物质分布的免疫荧光定位方法，提高了植物体内植物生长物质免疫荧光定位的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少。
附图说明
[0054]图1为本申请的方法中针对植物组织固定条件的验证结果，其中A表示采用了含2％EDC固定液处理后本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于植物的冷冻切片方法，其特征在于，其包括如下步骤：从植物体上选取任一植物器官的组织；利用含EDC的固定液进行植物组织的固定；利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织；利用OTC包埋剂包埋所述浸洗后的植物组织；利用冷冻切片机制备5～40μm厚的植物组织切片。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物器官包括：花、叶、茎、茎尖、根或根尖。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述植物组织来源于花、叶、茎尖或根尖时，所制备的植物组织切片的厚度不超过20μm；所述植物组织来源于茎或根时，所制备的植物组织切片的厚度不超过40μm。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定液包括：2％EDC、3％多聚甲醇、0.5％戊二醇、4％蔗糖、10mmol/L磷酸缓冲液，pH＝7.0。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用含EDC的固定液进行植物组织的固定，包括：在4℃的条件下，利用所述含EDC的固定液浸泡植物组织。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述利用所述含EDC的固定液浸泡植物组织，包括：所述植物组织离体后投入所述含EDC的固定液进行冰浴抽气固定0.5～1.5h，更换新鲜的所述含EDC的固定液之后在4℃的条件下浸泡4～5h。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织，包括：配制含4％蔗糖的10mmol/L磷酸缓冲液，调整pH至7.0；浸洗固定后的植物组织1～2h。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织之前，将所述固定后的植物组织切割至毫米尺寸。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用OTC包埋剂包埋所述浸洗后的植物组织，包括：利用可剥离容器容置外裹所述OTC包埋剂的植物组织；利用液氮浇注所述可剥离容器至整体固化成包埋块；将所述包埋块移入冷冻切片机的内腔至所述包埋块温度平衡；剥离所述可剥离容器之后将所述包埋块固定在所述冷冻切片机的样品托上。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述可剥离容器包括纸盒、薄膜盒中的任意一种。11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述液氮...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡博，翟琼，李玲，
申请(专利权)人：华南师大清远科技创新研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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