一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA-Ⅱ的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种检测方法及试剂盒，更具体一点说，涉及一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法及试剂盒，属于生物技术检测领域。

技术介绍

[0002]肝细胞癌(HCC)是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。由于缺乏有效的早期检测工具，无症状的HCC患者在晚期被诊断出来，导致预后不良。为了提高生存率，正在研究由维生素K缺失
‑
II(PIVKA
‑
II)诱导的血清生物标志物凝血酶原。PIVKA
‑
II是HCC中产生的异常蛋白。由于缺乏Gla残留物，凝血功能不足。PIVKA
‑
II升高与增殖，转移和侵袭方面的不良肿瘤行为有关。PIVKA
‑
II具有微创性，便利性和效率高等优点，可以从四个方面改善HCC管理。首先，PIVKA
‑
II是改善高危人群HCC监测的有效和动态工具。PIVKA
‑
II血清水平的变化在影像学发现之前提供了有价值的分子改变信息。其次，PIVKA
‑
II为HCC早期检测提供了一种补充方法。与传统的诊断方法相比，PIVKA
‑
II和其他生物标志物的组合具有更好的性能。第三，PIVKA
‑
II是评估HCC治疗反应的指标。术前评估用于选择个性化治疗，术后测量用于评估治疗效果。第四，PIVKA
‑
II被认为是HCC的预后预测因子。PIVKA
‑
II升高的患者更可能发生微血管浸润、转移和复发。因此，快速准确地检测待测样品中的PIVKA
‑
II含量具有重要的意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于提供具有可以检测待测样品中PIVKA
‑
II含量，效率高、特异性强、灵敏度高、重复性好等技术特点的一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法及试剂盒。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0005]本专利技术一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法，该检测方法包括：将PIVKA
‑Ⅱ
的包被抗体共价偶联于免疫磁珠表面，1mg抗体包被0.4mg磁珠，抗体与微球的孵育条件为室温避光旋转16h，利用离心管和磁力架对磁微球进行洗涤和分离，去除未结合的抗体，同时将Eu3+标记到PIVKA
‑Ⅱ
检测抗体上，并对抗体的使用量进行优化，确定适合的抗体使用剂量，用分析缓冲液进行稀释，避免检测抗体过量，将优化剂量的磁珠，Eu3+标检测抗体和待测样品，孵育条件为37℃震荡30min，形成磁珠
‑
包被抗体
‑
抗原
‑
Eu
3+
标记检测抗体的荧光免疫复合体，加入增强液对Eu
3+
进行解离，最后根据荧光强度进行检测分析；包被抗体磁珠是通过活化免疫磁珠表面的羧基[利用1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)]，将其与PIVKA
‑
II包被抗体上的氨基形成共价键，从而形成复合物。
[0006]所述荧光检测分析是指利用镧系稀土螯合物具有长寿命荧光这一特性，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集之前，根据样品中所包含的不同的荧光物质其荧光衰变时间
的各不相同通过延迟一定时间，在此时间段内待测样本中短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的稀土螯合物特异性荧光信号进行收集检测。通过时间分辨延迟可以有效消除来自样品、试剂、仪器等其它非特异性荧光的干扰，从而极大地提高检测的灵敏度。
[0007]优选的，将PIVKA
‑Ⅱ
的包被抗体共价偶联于免疫磁珠表面，形成免疫磁珠
‑
抗体复合物后，利用离心管和磁力架对磁性微球进行洗涤和分离，去除未结合抗体，样品制备过程中的离心管和磁力架，可用酶标板和96孔板磁力架替代。
[0008]优选的，免疫磁珠与PIVKA
‑Ⅱ
包被抗体形成偶联物过程的包被比例和孵育条件为：10μg抗体包被0.4mg磁珠，抗体与磁珠的孵育条件为室温避光旋转16h。
[0009]优选的，PIVKA
‑Ⅱ
包被抗体共价偶联于免疫磁珠表面，利用PIVKA
‑Ⅱ
包被抗体、待测样品中的PIVKA
‑Ⅱ
抗原、Eu
3+
标记的PIVKA
‑Ⅱ
检测抗体，通过双抗体夹心法进行检测。
[0010]优选的，荧光免疫复合体以Eu
3+
作为荧光示踪物，根据其荧光强度计算待测物含量。
[0011]优选的，Eu
3+
标记的PIVKA
‑Ⅱ
检测抗体量300μg，每mg抗体标记0.2mg Eu螯合物。
[0012]优选的，根据荧光强度进行检测分析包括：通过识别利用时间分辨荧光测量法和光谱分离技术排除样品中非特异性干扰，测定最后产物中的荧光强度，从而有效地提高了检测的灵敏度。
[0013]本专利技术一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测的试剂盒，包括试剂盒本体以及放在试剂盒本体内的多个药剂盒；其中，具有放置磁性微球的药剂盒，磁性微球包含有分别包被PIVKA
‑
II抗体的磁性微球；具有放置检测抗体的药剂盒，检测抗体包括分别标记Eu
3+
的PIVKA
‑
II抗体，具有放置PIVKA
‑
II标准品溶液的药剂盒，具有放置缓冲液的药剂盒，所述缓冲液为pH7.8的分析缓冲液和pH 3.2的增强液；试剂盒本体里设有可发性聚苯乙烯泡沫层，试剂盒本体包括盒体与盒盖，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒本体内的底部预制有存放碎冰的冰槽。
[0014]有益效果：本专利技术可以检测待测样品中PIVKA
‑
II含量，效率高、特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于HCC诊断和筛查，具有较好的应用前景；试剂盒使用可发性聚苯乙烯泡沫材质，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒底部预制有存放碎冰的冰槽，结构简单，实用性强。
附图说明
[0015]图1是本专利技术PIVKA
‑
II检测标准曲线图。
[0016]图2是本专利技术流程原理图。
具体实施方式
[0017]以下结合说明书附图，对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不局限于以下实施例。
[0018]免疫磁珠时间分辨技术利用免疫磁珠作为载体，以时间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法，其特点在于该检测方法包括：将PIVKA
‑Ⅱ
的包被抗体共价偶联于免疫磁珠表面，同时将Eu
3+
标记到PIVKA
‑Ⅱ
检测抗体上，利用双抗体夹心法，形成磁珠
‑
包被抗体
‑
抗原
‑
Eu
3+
标记检测抗体的荧光免疫复合体，加入增强液对Eu
3+
进行解离，最后根据荧光强度进行检测分析。2.如权利要求1所述的一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法，其特征在于：将PIVKA
‑Ⅱ
的包被抗体共价偶联于免疫磁珠表面，形成免疫磁珠
‑
抗体复合物后，利用离心管和磁力架对磁性微球进行洗涤和分离，去除未结合抗体。3.如权利1或2所述的一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法，其特点在于：免疫磁珠与PIVKA
‑Ⅱ
包被抗体形成偶联物过程的包被比例和孵育条件为：10μg抗体包被0.4mg磁珠，抗体与磁珠的孵育条件为室温避光旋转16h。4.如权利1所述的一种基于免疫磁珠时间分辨荧光免疫技术的PIVKA
‑Ⅱ
的检测方法，其特点在于：PIVKA
‑Ⅱ
包被抗体共价偶联于免疫磁珠表面，利用PIVKA
‑Ⅱ
包被抗体、待测样品中的PIVKA
‑Ⅱ
抗原、Eu
3+
标记的PIVKA
‑Ⅱ<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鑫栋，黄飚，郑天宇，周秀梅，秦源，赵雪琴，王毅刚，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：