一种基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IgG酶联免疫检测方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体的说是弓形虫TgIMP1C基因的原核表达和大量可溶性纯化，以及表达产物在弓形虫免疫学检测中的应用。本发明专利技术根据弓形虫TgIMP1的编码区序列，设计了可稳定表达纯化的核心结构域TgIMP1c引物，通过PCR扩增和分子克隆，构建了pET21b

【技术实现步骤摘要】
一种基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IgG酶联免疫检测方法


[0001]本专利技术涉及弓形虫病免疫学领域，尤其涉及一种基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IgG酶联免疫检测方法。

技术介绍

[0002]弓形虫病是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，Tg）引起的呈世界性分布的人兽共患传染病，为世界三大食源性病原体之一。弓形虫可穿越人体的胎盘屏障和血脑屏障，可对免疫缺陷人群，孕产妇等造成严重后果，亦可使正常成人罹患严重眼病或诱发精神行为障碍，全球每年因弓形虫病导致的经济损失达3亿美元。
[0003]目前弓形虫病常用的检测方法，主要包括病原学检测，影像学诊断，免疫学检测和分子诊断方法。其中，病原学检测方法需用实验动物反复转种，处死，操作复杂且不适宜用于大规模人体筛查和实验动物检测。影像学诊断方法易出现误诊，必须结合其他检测方法共同判定。
[0004]弓形虫的免疫学诊断是一种敏感而且特异性强的检测方法，是目前应用最广泛、最常见和最准确的试验方法，其中最常见的是以血清特异性抗体检测。我国应用最广的是间接ELISA和凝集试验，间接ELISA采用的诊断抗原包括速殖子可溶性提取物、排泄分泌抗原及各种重组抗原，如弓形虫表面蛋白SAG1、SAG2，分泌性抗原MIC3、GRA1、GRA7等，这些抗原多为溶解度较差的弓形虫编码的特异蛋白，如其中MIC3表达非常短暂，不适合用于检测长期慢性感染；而弓形虫速殖子可溶性提取物成分复杂，特异性较差。检测靶标一般为IgG及IgM抗体或循环抗原CAg。/>[0005]啮齿动物包括大鼠和小鼠均为弓形虫常见的中间宿主之一，普遍易感。实验室常用的大鼠和小鼠，均为弓形虫科学研究领域常见的实验动物，用于构建弓形虫急/慢性动物感染模型、研发新型防治措施。我国目前已基于上述抗原/抗体制备了多种检测试剂盒，但其特异性和敏感性与国外同类产品相比仍然有差距，临床应用的可靠性有待进一步评估。特别是目前能够用于检测实验动物的酶联免疫诊断试剂盒非常稀少，且价格昂贵，敏感性较差，濒临停产。
[0006]因此，研发一种成本低廉、灵敏度高、保质期长，能广泛用于实验室研究的啮齿类动物弓形虫抗体IgG检测试剂构件方法，是本领域技术人员亟需解决的一个技术问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于，克服现有技术不足之处，提供一种利用一种在弓形虫体内表达强度高、表达时间长、稳定可溶的表面抗原蛋白作为新型检测抗原，用于检测实验用鼠的弓形虫慢性感染情况的基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IGG酶联免疫检测方法。
[0008]所述检测方法包括以下步骤：1.可用于预包被的TgIMP1c可溶性抗原的基因扩增和重组表达质粒的构建；具体
包括以下实施步骤：通过常规基因克隆和原核表达纯化手段获取。根据Genbank中弓形虫强毒RH株速殖子的 IMP1 基因序列（JN657189.1）设计引物。用于TgIMP1c（即TgIMP1的23
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396aa之间的核心结构域蛋白片段）基因克隆的引物序列为：TgIMP1
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5'
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23
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Nde I: GGAATTC CAT ATG GCTGACGAGGCTGAGCGAACAGTgIMP1
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3'
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396
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Xho I: TTTCTCGAG GTCCACCATTCGGCCATCAAG以强毒RH株弓形虫cDNA为模板，常规PCR法扩增TgIMP1c基因片段，Nde I和Xho I双酶切阳性扩增片段和pET21b空载体，胶回收后按照载体与目的片段 1∶8 的摩尔比，将TgIMP1c片段连入pET21b质粒载体中，构建阳性pET21b
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TgIMP1c重组表达质粒并测序鉴定，鉴定结果表明，TgIMP1c基因片段成功连入pET21b表达质粒中。
[0009]2.TgIMP1c可溶性抗原重组蛋白的原核表达和体外大量分离纯化；3. 预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳包被抗原浓度和最适血清样品稀释度的确定；4. 预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳包被条件的确定；5. 预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳封闭条件的确定；6. 酶标二抗的工作浓度的确定；7. 试剂盒的结果判定标准的确定；8.试剂盒的特异性、敏感性及符合率的确定；9. 试剂盒的交叉反应的确定；10. 试剂盒的重复性反应的确定；11.试剂盒的保存期与稳定性反应的确定。
[0010]进一步的，所述TgIMP1c可溶性抗原重组蛋白的原核表达和体外大量分离纯化方法为：阳性pET21b
‑
TgIMP1c重组表达质粒常规转化入大肠杆菌Rosetta 2感受态细胞，在大肠杆菌中原核表达TgIMP1c重组蛋白，重组蛋白经亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析共计三步层析法分离纯化后，最终获取可稳定保存于磷酸盐缓冲液中的，具备高浓度和高纯度，生物活性高的TgIMP1c可溶性蛋白抗原。
[0011]进一步的，所述预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳包被抗原浓度和最适血清样品稀释度的确定具体方法为：用抗原包被液将纯化的重组 TgIMP1c蛋白分别稀释成40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL 和 1.25μg/mL 等6个浓度梯度进行包被 ELISA 96孔板，100μL/孔，每个稀释度横向包被12孔，纵向重复2列。4℃包被过夜，丢弃包被液，用PBST(0.05%Tween20+0.01mol/LPBS)洗涤3次，每次2 min，甩干。每孔加入 200μL含10%小牛血清封闭液，于37℃封闭 2.0 h，甩干，用 PBST 洗涤液洗涤3 次。将40份弓形虫标准阳性血清和20份弓形虫标准阴性血清用 PBST 分别按 1:10、1:40、1:80、1:100、1:150、1:200 比例进行稀释，每个稀释度重复3次，加入 ELISA 反应孔，100μL/孔 ，37℃反应 60 min。甩干，洗涤3次，加入酶标二抗，100μL/孔，37℃反应 45 min，甩干，洗涤3次，加入TMB 底物，室温避光静止20 min，测定OD
450 nm，同时，阴性血清 OD
450
nm较低为最适反应条件，通过“方阵法”确定最佳抗原的包被浓度和最适血清的稀释倍数。
[0012]进一步的，所述预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳包被条件的确定方法为：以确定的最佳抗原浓度包被 ELISA 96 孔板，100μL /孔。分别设置 4 个包被条件，第 1 组：4
℃ 包被过夜；第 2 组：37℃ 包被 2.0 h；第 3 组：37℃ 30min+4℃过夜；第四组：37℃ 1.0h+4℃过夜。按最适血清稀释倍数和常规 ELISA 操作程序进行检测，确定最佳的包被条件。进一步的，所述预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳封闭条件的确定方法为：以最佳的抗原包被浓度包被酶标板，洗涤后分成3组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IGG酶联免疫检测方法，包括以下步骤：1.可用于预包被的TgIMP1c可溶性抗原的基因扩增和重组表达质粒的构建；具体包括以下实施步骤：通过常规基因克隆和原核表达纯化手段获取；根据Genbank中弓形虫强毒RH株速殖子的IMP1基因序列（JN657189.1）设计引物；用于TgIMP1c（即TgIMP1的23
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396aa之间的核心结构域蛋白片段）基因克隆的引物序列为：TgIMP1
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5'
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NdeI:GGAATTCCATATGGCTGACGAGGCTGAGCGAACAGTgIMP1
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XhoI:TTTCTCGAGGTCCACCATTCGGCCATCAAG以强毒RH株弓形虫cDNA为模板，常规PCR法扩增TgIMP1c基因片段，NdeI和XhoI双酶切阳性扩增片段和pET21b空载体，胶回收后按照载体与目的片段1∶8的摩尔比，将TgIMP1c片段连入pET21b质粒载体中，构建阳性pET21b
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TgIMP1c重组表达质粒并测序鉴定，鉴定结果表明，TgIMP1c基因片段成功连入pET21b表达质粒中；2.TgIMP1c可溶性抗原重组蛋白的原核表达和体外大量分离纯化；3.预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳包被抗原浓度和最适血清样品稀释度的确定；4.预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳包被条件的确定；5.预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳封闭条件的确定；6.酶标二抗的工作浓度的确定；7.试剂盒的结果判定标准的确定；8.试剂盒的特异性、敏感性及符合率的确定；9.试剂盒的交叉反应的确定；10.试剂盒的重复性反应的确定；11.试剂盒的保存期与稳定性反应的确定。2.根据权利要求1所述的一种基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IGG酶联免疫检测方法，其特征在于，所述TgIMP1c可溶性抗原重组蛋白的原核表达和体外大量分离纯化方法为：阳性pET21b
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TgIMP1c重组表达质粒常规转化入大肠杆菌Rosetta2感受态细胞，在大肠杆菌中原核表达TgIMP1c重组蛋白，重组蛋白经亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析共计三步层析法分离纯化后，最终获取可稳定保存于磷酸盐缓冲液中的，具备高浓度和高纯度，生物活性高的TgIMP1c可溶性蛋白抗原。3.根据权利要求1所述的一种基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IGG酶联免疫检测方法，其特征在于，所述预包被的TgIMP1c可溶性抗原的最佳包被抗原浓度和最适血清样品稀释度的确定具体方法为：用抗原包被液将纯化的重组TgIMP1c蛋白分别稀释成40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.25μg/mL等6个浓度梯度进行包被ELISA96孔板，100μL/孔，每个稀释度横向包被12孔，纵向重复2列；4℃包被过夜，丢弃包被液，用PBST(0.05%Tween20+0.01mol/LPBS)洗涤3次，每次2min，甩干；每孔加入200μL含10%小牛血清封闭液，于37℃封闭2.0h，甩干，用PBST洗涤液洗涤3次；将40份弓形虫标准阳性血清和20份弓形虫标准阴性血清用PBST分别按1:10、1:40、1:80、1:100、1:150、1:200比例进行稀释，每个稀释度重复3次，加入ELISA反应孔，100μL/孔，37℃反应60min；甩干，洗涤3次，加入酶标二抗，100μL/孔，37℃反应45min，甩干，洗涤3次，加入TMB底物，室
温避光静止20 min，测定OD
450 nm，同时，阴性血清 OD
450
nm...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹昆，赵桂华，徐超，徐昊志，谢环环，代莉莎，
申请(专利权)人：山东省寄生虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：