一种分级富集癌细胞及类器官的方法、装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种分级富集癌细胞及类器官的方法，将无消化酶细胞回收液与内含类器官及散在细胞的水凝胶混合并孵育，得水凝胶液化液；再将含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液或磷酸盐缓冲液与水凝胶液化液混合，得到水凝胶液化稀释液；将水凝胶液化稀释液缓慢倒入置于容器内的过滤器内并震动过筛，所述过滤器为多层筛网竖直间隔排列且由下至上孔径逐层递增；将筛网由上至下逐层取出并分别倒扣于内有细胞培养液的不同容器中，将滤上物洗脱至细胞培养液中；将含有滤上物的细胞培养液离心，弃上清，得到癌细胞及类器官。得到癌细胞及类器官。得到癌细胞及类器官。

【技术实现步骤摘要】
一种分级富集癌细胞及类器官的方法、装置


[0001]本专利技术涉及一种癌细胞及类器官的收集方法、装置，尤其是一种分级富集癌细胞及类器官的方法、装置。

技术介绍

[0002]类器官（Organoid）是一种在半固态基质凝胶中由具有增殖能力的干细胞、正常细胞或肿瘤细胞形成的多细胞三维（3D）立体结构。由于类器官在表型和功能上很好地保留了其来源组织的形态学特点、生物学功能和分子特征，且因可
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替身试药”而明显减少不必要的实验动物损耗，规避人体试验的伦理学问题，故类器官已作为新型离体实验模型用于生物医学研究和药物研发，在诸如疾病模型构建及防治、组织再生、损伤修复、器官移植技术改良、癌症的药敏筛查和疗效评估、用药安全性评价等领域有十分广阔的应用前景。许多生物医学研究要求在实验体系内细胞的数量和/或类器官的数量及体积尽可能均一，以避免结果偏差，使获得的数据具有可靠性、可重复性，易于进行高通量分析。
[0003]现有类器官的构建方法大多是将来源于多能干细胞、动物组织和患者标本制成的细胞悬液接种到内含IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)以及多种生长因子的Engelbreth
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Holm
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Swarm (EHS)小鼠肉瘤基底膜提取物胶状物/凝胶中进行体外3D培养（细胞悬液和凝胶的比例为1：2）；3D培养过程中，细胞在不断分裂增殖形成细胞团(spheroids)的同时，还可通过彼此间的相互作用和信号通讯结为一体，形成大小不一的类器官。类器官随着体积逐渐增长，会经历从形成、成长及成熟稳定等动态过程，处于成熟稳定期的类器官如继续增大，其内部细胞可能存在乏氧和营养不良以及由此所致的细胞自噬和凋亡等问题，从而进入退化、衰老乃至死亡等过程；另外，当使用组织进行类器官培养时，通常存在多种类型细胞在培养体系内混杂共生的情况。上述情形给针对某一特定类型细胞如癌细胞及其类器官的定量分析（特别是自动化的高通量分析）造成很大困难，难以保证上述医学研究和检测结果的可靠性。
[0004]目前，已有根据细胞的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态差异进行检测定性或定量的流式细胞分选和基于细胞生物标记物的抗体偶联磁性细胞分选术，但只限于分选单个细胞而非形态何大小各异的类器官；上述两种方法不仅操作复杂，耗时较长，同时因仪器价格不菲而导致实验成本高，更重要的是容易造成细胞损伤和细菌污染，从而大大降低离体实验模型的成功率。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种分级富集癌细胞及类器官的方法、装置。
[0006]本专利技术的技术解决方案是：一种分级富集癌细胞及类器官的方法，依次按照如下步骤进行：步骤1. 将无消化酶的细胞回收液与内含类器官及散在细胞的基质胶或水凝胶按
照体积比为1：15
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20混合，孵育1
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2个小时，得凝胶液化液；步骤2. 再将含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液或磷酸盐缓冲液与水凝胶液化液按照体积比为1：20
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50混合，得到水凝胶液化稀释液；步骤3. 将水凝胶液化稀释液缓慢倒入置于容器内的过滤器内并震动过筛，所述过滤器为多层筛网竖直间隔排列且由下至上孔径逐层递增，每层筛网构成独立滤室，最下层纱网与容器底部间隔设置，所述容器内有液面没过顶层筛网的细胞培养液，所述每层筛网的孔径均一且分别为10
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20 μm、20
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30 μm、45
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55 μm、75
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85 μm、115
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125 μm、145
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155 μm及195
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205 μm；步骤4. 将筛网由上至下逐层取出，并分别倒扣于内有细胞培养液的不同容器中，将滤上物洗脱至细胞培养液中；步骤5. 将含有滤上物的细胞培养液离心，弃上清，得到癌细胞及类器官。
[0007]一种上述分级富集癌细胞及类器官的方法用装置，设有过滤器，所述过滤器由竖直排列且可拆卸连接的多个滤室构成，所述滤室由侧壁及位于底部的筛网相接而成，所述筛网由下至上孔径逐层递增，每层筛网的孔径均一且分别为10
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20 μm、20
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30 μm、45
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55 μm、75
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85 μm、115
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125 μm、145
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155 μm及195
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205 μm。
[0008]所述最上层滤室的外部固定有把手。
[0009]所述多个滤室之间螺纹连接。
[0010]优选的在过滤器外设有容器，所述容器下面有底座。
[0011]本专利技术可通过一次性过筛，分别收集不同尺寸的类器官，以便将健康状态欠佳的过大类器官弃之或用于其它研究目的如基因组DNA提取和高通量检测，较大但仍健康的类器官可以冻存建库或加以消化传代，适中的类器官作为离体模型用以实验，而较小的类器官则继续培养。同时可通过尺寸对癌细胞与普通细胞进行区分，以满足不同实验对癌细胞的需要。具有方法简单，操作时间短且可避免细胞损伤和细菌污染等优点。
附图说明
[0012]图1是本专利技术实施例1所用装置的结构示意图。
具体实施方式
[0013]本专利技术实施例所用装置如图1所示，设有过滤器1，所述过滤器1由竖直排列且通过螺纹或插接等可拆卸连接的多个滤室2构成，所述滤室2由塑料等侧壁2
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1及位于底部的筛网2
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2相接而成，所述筛网2
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2由下至上孔径逐层递增，每层筛网2
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2的孔径均一且分别为15 μm、25 μm、50 μm、80 μm、120 μm、150 μm及200 μm。最好是在最上层滤室3的外部固定把手3（如夹持器等），过滤器1外设有容器4，容器4下面有底座5。需要指出的是，由于不同类型肿瘤细胞的直径有所差异，其形成的成熟稳定类器官在大小上也不尽相同，故需要事先测量肿瘤细胞的大小（平均直径），根据具体情况和实验需要对筛网孔径在相应的范围内做必要的调整。
[0014]本专利技术实施例的分级富集癌细胞及类器官的方法，依次按照如下步骤进行：步骤1. 将无消化酶的Corning Cell Revovery Solution细胞回收液与内含类器官及散在细胞的水凝胶按照体积比为1：20混合，在4摄氏度或常温下孵育1
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2个小时（具体
时间视基质胶的容积而定），得水凝胶液化液；步骤2. 再将含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液或磷酸盐缓冲液（PBS）与水凝胶液化液按照体积比为1：20
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50混合，得到水凝胶液化稀释液，达到降低水凝胶液化液粘稠度，充分释出细胞和类器官的目的；步骤3. 将水凝胶液化稀释液缓慢倒入置于容器内的图1所示的过滤器1内，所述容器4内有液面没过顶层筛网3
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2的细胞培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分级富集癌细胞及类器官的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：步骤1. 将无消化酶细胞回收液与内含类器官及散在细胞的水凝胶按照体积比为1：15
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20混合，孵育1
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2个小时，得水凝胶液化液；步骤2. 再将含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液或磷酸盐缓冲液与水凝胶液化液按照体积比为1：20
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50混合，得到水凝胶液化稀释液；步骤3. 将水凝胶液化稀释液缓慢倒入置于容器内的过滤器内并震动过筛，所述过滤器为多层筛网竖直间隔排列且由下至上孔径逐层递增，每层筛网构成独立滤室，最下层纱网与容器底部间隔设置，所述容器内有液面没过顶层筛网的细胞培养液，所述每层筛网的孔径均一且分别为10
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20 μm、20
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30 μm、45
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55 μm、75
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85 μm、115
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125 μm、145
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150 μm及195
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205 μm；步骤4. 将筛网由上至下逐层取出，并分别倒扣于内有细胞培养液的不同容器中，将滤上物洗脱至细胞培养液中；步骤5. 将含有滤上物的细胞培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏，李胜，
申请(专利权)人：广州精科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：