本发明专利技术公开了玛咖免疫调节蛋白酶解物或肽及其制备方法与应用，属于农产品深加工及其副产品综合利用的技术领域。本发明专利技术以通过对玛咖蛋白进行预酶解以及模拟胃肠消化处理，得到具有免疫调节活性的玛咖免疫调节蛋白酶解物，并进一步通过超滤、测序、活性评分、分子对接以及合成得到玛咖免疫调节肽。该方法制备所得玛咖免疫调节蛋白酶解物及肽具有较高的免疫调节活性，能被作为活性成分用于功能性食品的生产。本发明专利技术具有新颖、简单及高效的特点，易于实现工厂化生产，为玛咖深加工提供新的发展方向，为实现玛咖蛋白的高值化利用提供新的可能。能。能。
【技术实现步骤摘要】
264.7 表达TNF
‑
α的促进能力较弱，纯化步骤复杂(He P,Pan L,Wu H,et al.Isolation,identification, and immunomodulatory mechanism of peptides from Lepidium meyenii(maca)proteinhydrolysate[J].Journal ofagricultural and food chemistry,2022,70(14):4328
‑
4341.)。
技术实现思路
[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供玛咖免疫调节蛋白酶解物或肽及其制备方法与应用。
[0007]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0008]玛咖免疫调节蛋白酶解物的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)制备玛咖蛋白：取玛咖根茎粉末为原料，以Tris
‑
HCl水溶液(pH 7.0～pH 9.0)为提取液进行提取，料液比为1：20～1：40，超声(50℃～70℃，200W～250W，20min～30min)，提取时间为30min～60min，提取温度为50℃～70℃。第一次离心(3000rpm～4000rpm，5 min～15min)、过滤取上清液，加入0.5mol/L～1.0mol/LHCl水溶液至上清液pH达到3.5～4.0，静置30min～40min后第二次离心(3000rpm～4000rpm，10min～20min)，用0.5mol/L～1.0 mol/LNaOH水溶液复溶沉淀，透析脱盐(1000Da～5000Da)，冻干得玛咖蛋白。
[0010](2)预酶解：取步骤(1)得到的玛咖蛋白配成1％～2％(w/v，g/mL)的玛咖蛋白溶液，第一次沸水浴加热10min～20min，使玛咖蛋白中蛋白酶抑制剂失活。加入蛋白酶，将温度和 pH调至各蛋白酶的最适条件，预热10min～20min。在酶解过程中，前10min～30min，每5 min～15min调节一次pH，随后每10min～30min调节一次pH，使pH保持恒定。酶解时间3 h～4h，反应结束后，将酶解液置于沸水浴中第二次沸水浴加热10min～20min以终止反应。
[0011](3)模拟胃肠消化：
①
模拟胃消化阶段：滴加0.5mol/L～1.0mol/L的HCl水溶液使pH 达到1.5～3.0，在温度达到36℃～37℃后加入胃蛋白酶，磁力搅拌反应2h～3h；
②
模拟肠消化阶段：滴加0.5mol/L～1mol/L的NaOH水溶液使pH达到6.5～7.5终止模拟胃消化，加入胰酶，36℃～37℃磁力搅拌反应2h～3h。随后将溶液pH调至7.0～7.5，煮沸10min～20min使反应完全结束，冷却后离心(3000rpm～4000rpm，10min～20min)，取上清液透析(截留量 100Da～500Da)，再冷冻干燥得玛咖免疫调节蛋白酶解物。
[0012]优选地，步骤(1)中所述Tris
‑
HCl水溶液的浓度为0.05mol/L。
[0013]优选地，步骤(1)中，所述提取的条件为：料液比为1：30，超声(60℃，250W，20min)，提取的时间为30min，提取的温度为60℃。
[0014]优选地，步骤(1)中，所述第一次离心的条件为4000rpm，5min；第二次离心的条件为4000rpm，10min。
[0015]优选地，步骤(1)中所述过滤为使用500目滤布过滤。
[0016]优选地，步骤(1)中，所述HCl水溶液的浓度为1.0mol/L，NaOH水溶液的浓度为0.6mol/L。
[0017]优选地，步骤(1)中添加HCl水溶液后体系pH为3.75。
[0018]优选地，步骤(1)中所述透析脱盐的截留量为2000Da～5000Da。
[0019]优选地，步骤(1)中所述透析脱盐的截留量为5000Da。
[0020]优选地，步骤(1)中所述玛咖蛋白的蛋白质含量为87.02％。
[0021]优选地，步骤(2)中所述玛咖蛋白溶液的浓度为1％(w/v，g/mL)。
[0022]优选地，步骤(2)中在酶解过程中，前20min～30min，每5min～10min调节一次pH，随后每10min～20min调节一次pH。
[0023]优选地，步骤(2)中，所述第一次沸水浴加热的时间为10min，预热时间为10min，酶解时间为3h，第二次沸水浴加热的时间为10min。
[0024]优选地，步骤(2)中所述蛋白酶的酶活需达到2.0
×
104U。
[0025]优选地，步骤(2)中所述蛋白酶的种类范围包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及复合蛋白酶中的一种。
[0026]优选地，步骤(2)中蛋白酶最适条件分别为：中性蛋白酶温度为45℃，pH为7.5；碱性蛋白酶温度为40℃，pH为10.5；木瓜蛋白酶温度为55℃，pH为7.0；菠萝蛋白酶温度为 55℃，pH为7.0；复合蛋白酶温度为45℃，pH为7.0。
[0027]优选地，步骤(3)中，所述HCl水溶液的浓度为1.0mol/L，NaOH水溶液的浓度为1.0mol/L。
[0028]优选地，步骤(3)中，所述胃蛋白酶的酶活需达到3000U/mg，胰酶的酶活需达到8U/mg。
[0029]优选地，步骤(3)中，模拟胃消化阶段的条件为：pH为3.0，温度为37℃，反应时间为2h；模拟肠消化阶段的条件为：pH为7.0，温度37℃，反应时间为2h。
[0030]优选地，步骤(3)中，透析截留量为100Da～500Da。
[0031]优选地，步骤(3)中，所述煮沸的时间为10min；离心的条件为4000rpm，20min；透析截留量为100Da。
[0032]优选地，步骤(3)所述玛咖免疫调节蛋白酶解物的得率为39％～56％，水解度为 56.38％～57.06％，可溶性肽得率为23.23％～33.45％，游离氨基酸含量为540.89～758.76mg/100 g玛咖蛋白。
[0033]优选地，步骤(3)中所述玛咖免疫调节蛋白酶解物在浓度为500μg/mL时，促进小鼠巨噬细胞RAW 264.7表达细胞因子TNF
‑
α的水平为17.08～20.43ng/mL，较空白组提高了 280.40％～355.01％。
[0034]优选地，步骤(1)和步骤(3)中透析用水包括蒸馏水、纯净水、去离子水及自来水中的任意一种，透析温度应保持在4℃。
[0035]本专利技术提供玛咖免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
[0036]筛选及制备玛咖免疫调节肽：选取上述步骤(3)的经蛋白酶预酶解处理的玛咖免疫调节蛋白酶解物配制成玛咖免疫调节蛋白酶解物溶液(0.25mg/mL～1.0mg/mL)，先后经过截留量为10kDa(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.玛咖免疫调节蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备玛咖蛋白：取玛咖根茎粉末为原料，以pH 7.0～pH 9.0的Tris
‑
HCl溶液为提取液进行提取，超声后提取，第一次离心、过滤取上清液，加入0.5mol/L～1.0mol/LHCl溶液调节pH至3.5～4.0，静置30min～40min后第二次离心，用0.5mol/L～1.0mol/LNaOH溶液复溶沉淀，透析脱盐截留量为2000Da～5000Da，冻干得玛咖蛋白；(2)预酶解：使用步骤(1)得到的玛咖蛋白配制玛咖蛋白溶液，第一次沸水浴加热10min～20min，加入蛋白酶，调节温度和调节pH，预热10min～20min，在酶解过程中，前10min～30min，每5min～15min调节一次pH，随后每10min～30min调节一次pH，使pH保持恒定，酶解时间3h～4h，反应结束后，将酶解液置于沸水浴中第二次沸水浴加热10min～20min以终止反应；(3)模拟胃肠消化：模拟胃消化阶段：加入胃蛋白酶磁力搅拌反应，调节pH终止模拟胃消化；模拟肠消化阶段：加入胰酶磁力搅拌反应，随后将酶解体系pH调至7.0～7.5，煮沸10min～20min使反应完全结束，冷却后离心，取上清液透析截留量为100Da～500Da，再冷冻干燥得玛咖免疫调节蛋白酶解物。2.根据权利要求1所述玛咖免疫调节蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述超声的条件为200W～250W，20min～30min，50℃～70℃；步骤(1)中所述提取的条件为30min～60min，50℃～70℃。3.根据权利要求1所述玛咖免疫调节蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一次离心的条件为3000rpm～4000rpm，5min～15min；第二次...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晖，潘蕾蔓，张猛猛，贺萍，赖富饶，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。