一种检测HIV-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测HIV

【技术实现步骤摘要】
一种检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的技术。

技术介绍

[0002]HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒。人体感染HIV后逐渐丧失免疫功能，因而易罹患不同疾病，也发生恶性肿瘤，病死率高。抗HIV治疗技术中，以整合酶为治疗靶点之一，人们已开发多种整合酶抑制剂与其他药物配合治疗控制艾滋病发展。由于HIV在病毒复制过程中高突变特性以及抗HIV药物的使用导致HIV耐药突变的情况出现，检测整合酶区基因是否发生耐药突变对于分析整合酶抑制剂药效非常重要。现有检测方法有基因型分析法，首先RT
‑
PCR扩增目的基因，再测序分析耐药突变情况，然而现有技术对HIV整合酶基因扩增灵敏度局限，扩增失败情况常见，面对不同亚型的HIV整合酶需要设计不同的引物，导致检测工作繁琐。因此，研发高灵敏度覆盖范围广的HIV整合酶耐药突变技术，为研发新药物、为患者探索更适合的治疗方案提供基础是有必要的。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的之一在于提供一种检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的引物组。
[0004]为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
[0005]一种检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的引物组，包括扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
[0006]进一步地，还包括测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～8所示。
[0007]本专利技术还提供所述的引物组在检测HIV
‑
1整合酶耐药突变中的应用。
[0008]优选地，所述HIV
‑
1整合酶选自亚型为CRF01
‑
AE、CRF08
‑
BC、C、CRF07
‑
BC的HIV
‑
1。
[0009]本专利技术还提供一种用所述的引物组检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的方法，步骤包括：提取HIV
‑
1核酸作为模板，以权利要求2的引物组作为RT
‑
PCR、PCR、测序PCR扩增引物进行反应，对产物进行测序分析，得到突变类型信息。
[0010]本专利技术还提供所述的引物组在制备检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术还提供一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，包括RT
‑
PCR扩增体系和PCR扩增体系，
[0012]RT
‑
PCR扩增体系包括：
[0013](a)RT
‑
PCR反应液14μL，其中包括包含dNTP Mixture及Mg
2+
的2
×
One
‑
Step MasterMix 12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；
[0014](b)RT
‑
PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U。
[0015](c)10μL HIV
‑
1病毒核酸；
[0016]PCR扩增体系包括：
[0017](a)PCR反应液42μL，其中包括含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；
[0018](b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水；
[0019](c)RT
‑
PCR扩增产物5μL。
[0020]本专利技术还提供一种应用所述的扩增体系的扩增方法，过程是：
[0021]首先进行RT
‑
PCR扩增，反应程序为：
[0022](a)50℃30min；
[0023](b)94℃预变性5min；
[0024](c)94℃变性20s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；
[0025](d)72℃延伸10min，4℃保温；
[0026]RT
‑
PCR扩增完成后，进行PCR扩增，反应程序为：
[0027](a)94℃预变性5min；
[0028](b)94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，3个循环；
[0029](c)94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；
[0030](d)72℃延伸5min，4℃保温。
[0031]本专利技术还提供一种包含所述的引物组的扩增测序体系，包括RT
‑
PCR扩增体系、PCR扩增体系、测序PCR体系，
[0032]RT
‑
PCR扩增体系包括：
[0033](a)RT
‑
PCR反应液14μL，其中包括包含dNTP Mixture及Mg
2+
的2
×
One
‑
Step Master Mix 12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；
[0034](b)RT
‑
PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U；
[0035](c)10μL HIV
‑
1病毒核酸；
[0036]PCR扩增体系包括：
[0037](a)PCR反应液42μL，其中包括含Mg
2+
的10
×
PCR buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；
[0038](b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水；
[0039](c)RT
‑
PCR扩增产物5μL；
[0040]测序PCR体系20μl，其包括：
[0041](a)Bigdye 2μl；
[0042](b)Bigdye buffer 3μl；
[0043](c)3.2μM测序引物1μl；
[0044](d)纯化得到的PCR产物10～100ng或Xμl，X取值为1
‑
5；
[0045](e)无菌水余量。
[0046]测序引物如SEQ ID NO.5～8所示，共4条测序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的引物组，其特征在于：包括扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。2.根据权利要求1所述的一种检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的引物组，其特征在于：还包括测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～8所示。3.如权利要求1或2所述的引物组在检测HIV
‑
1整合酶耐药突变中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述HIV
‑
1整合酶选自亚型为CRF01
‑
AE、CRF08
‑
BC、C、CRF07
‑
BC的HIV
‑
1。5.一种用权利要求2所述的引物组检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的方法，其特征在于：步骤包括：提取HIV
‑
1核酸作为模板，以权利要求2的引物组作为RT
‑
PCR、PCR、测序PCR扩增引物进行反应，对产物进行测序分析，得到突变类型信息。6.如权利要求1或2所述的引物组在制备检测HIV
‑
1整合酶耐药突变的试剂盒中的应用。7.一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，其特征在于：包括RT
‑
PCR扩增体系和PCR扩增体系，RT
‑
PCR扩增体系包括：(a)RT
‑
PCR反应液14μL，其中包括包含dNTP Mixture及Mg
2+
的2
×
One
‑
Step Master Mix 12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；(b)RT
‑
PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U。(c)10μL HIV
‑
1病毒核酸；PCR扩增体系包括：(a)PCR反应液42μL，其中包括含Mg
2+
的10
×
PCR buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；(b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水；(c)RT
‑
PCR扩增产物5μL。8.一种应用如权利要求7所述的扩增体系的扩增方法，其特征在于：过程是：首先进行RT
‑
PCR扩增，反应程序为：(a)50℃30min；(b)94℃预变性5min；(c)94℃变性20s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；(d)72℃延伸10min，4℃保温；RT
‑
PCR扩增完成后，进行PCR扩增，反应程序为：(a)94℃预变性5min；(b)94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，3个循环；(c)94℃变...

【专利技术属性】
技术研发人员：李葆华，甘小洪，余治学，刘菲，陈曦，
申请(专利权)人：广州立菲达安诊断产品技术有限公司，
类型：发明
国别省市：