一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及动物病毒学技术领域，具体涉及一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法，试剂盒包括iiPCR扩增液，所述iiPCR扩增液包括Taq DNA聚合酶、MMLV反转酶和引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对及第一探针、第二引物对及第二探针、第三引物对及第三探针、第四引物对及第四探针。本发明专利技术针对临床中猪的肠道内容物、粪便、肛门拭子等样品，经核酸提取，可直接将RNA作为模板，即可完成iiPCR检测，特异性良好，且灵敏度与荧光定量PCR相当。量PCR相当。

【技术实现步骤摘要】
一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及动物病毒学
，尤其涉及一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]随着我国生猪产业集约化养殖的普及，多种病原可引起相似的临床症状 (称之为“症候群”)，临床中很难通过大体剖检进行确诊，因此需要对同一症候群下的不同病原进行鉴别诊断。仔猪病毒性腹泻就是阻碍中国养猪业健康发展的一种典型的多因素性疾病。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)以及猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是当前引起猪病毒性腹泻的主要病原，各种年龄段的猪群均易感染，特别是对新生仔猪危害最为严重，其临床症状具有相似性，均表现为腹泻、呕吐、脱水和食欲下降等，在病理变化和流行病学等方面也极为相似，且这四种病毒常呈混合感染，给猪病的监测和诊断造成了困难。因此，确定哪种病毒是引起该症候群的主要病原是采取相应防控措施的首要问题。
[0003]根据S基因的分子特性，PEDV可以分为2个基因大群，目前我国流行的主要是PEDV变异毒株(基因型Ⅱb)，而TGEV不同地区来源的各毒株间S基因差异性不大，S基因变异仍较低且相对比较稳定，这有可能是目前TGEV感染率较低的原因。我国流行的PoRV基因型为G9、G11、G2、G4、 G5、G26和G3，P基因型为P[6]、P[7]、P[13]、P[19]、P[23]和P[34]，其中以P[13]、P[19]、P[23]为主。当前从各大洲分离到的PoRV最流行的毒株仍是OSU，其基因型组合为G5P[7]，我国主要流行的也是该株轮状病毒。各地猪场分离出的PEDV阳性率最高，其次是PoRV，TGEV则较低，近些年 PDCoV的发病率有上升的趋势。PEDV常与TGEV、PoRV等混合感染, TGEV/PoRV混合感染较少或不存在，不同地区猪场混合感染存在差异。许多地区存在TGEV/PEDV、TGEV/PoRV、PEDV/PoRV双重感染或 PEDV/TGEV/PoRV三重感染，但以PEDV/PoRV双重感染为主。
[0004]传统的PCR检测技术必须在专业实验室才能进行操作，需要专门的仪器设备，操作步骤繁琐，耗时长、成本高，操作人员需要专业培训。因此，对病原学检测，开发及时检测(Point
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of
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care testing,POCT)技术，在现场采样即可进行分析，省去样品在实验室检验时的处理程序，能够快速、精准得到检测结果的诊断技术是现代兽用疫病诊断的市场需求和发展趋势。
[0005]快速、精准的现场诊断对该病的防治尤为重要，病原检测可以提供感染的直接证据。2002年Krishnar等对荧光定量PCR检测仪器进行了改进和创新，研发出基于TaqMan探针原理的恒温隔绝式PCR(insuated isothermalPCHiiPCR)系列检测仪，其中手持式POCKIT自重仅380g，自带电源，一键操作即可在42min内完成检测，结果直接显示在液晶屏上，实现了病原分子检测的小型化、便捷化，特别适用于现场的快速诊断。目前国外已建立了虾白斑
病、犬瘟热、犬细小病毒病、猪瘟、马流感等iiPCR检测方法，其中检测虾白斑病的iiPCR方法获得了OIE的认证，但是将iiPCR技术运用到猪群腹泻症候群鉴别诊断方面的报道甚少。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提供一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法，目的是实现快速、精准地鉴别猪病毒性腹泻类病毒PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV，且具有灵敏度高、特异性好的特性。
[0007]基于上述目的，本专利技术提供了一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的 iiPCR试剂盒，包括iiPCR扩增液，所述iiPCR扩增液包括Taq DNA聚合酶、 MMLV反转酶和引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对及第一探针、第二引物对及第二探针、第三引物对及第三探针、第四引物对及第四探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的PEDV上游引物和如SEQ IDNO.2所示的PEDV下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的 PEDV探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的TGEV上游引物和如SEQ ID NO.5所示的TGEV下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6 所示的TGEV探针，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.7所示的PoRV上游引物和如SEQ ID NO.8所示的PoRV下游引物，所述第三探针包括如SEQ IDNO.9所示的PoRV探针，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.10所示的 PDCoV上游引物和如SEQ ID NO.11所示的PDCoV下游引物，所述第四探针包括如SEQ ID NO.12所示的PDCoV探针。
[0008]作为一种可选的实施方式，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0009]优选的，所述阳性对照为进行灭活处理过的PEDV、TGEV、PoRV、 PDCoV病毒液，接毒剂量为1
×
106TCID
50
/mL；阴性对照为Nuclease
‑
free 水。
[0010]作为一种可选的实施方式，所述试剂盒还包括待测样品。
[0011]可选的，所述待测样品为猪的肠内容物、粪便或肛门拭子中的一种。
[0012]优选的，所述iiPCR扩增液的用量为48μl，添加模板量为2μl，iiPCR 扩增液包括(Premix缓冲液)dNTP、Tris
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Buffer、EDTA、DTT、甘油和Tween
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20，含量分别为0.5mM、10mM、0.05mM、0.05mM、30％V/V和0.1％ V/V，Taq DNA聚合酶的浓度0.1U/μl、MMLV反转录酶的浓度为0.5U/μl， PEDV上游引物、TGEV上游引物、PoRV上游引物、PDCoV上游引物、PEDV 下游引物、TGEV下游引物、PoRV下游引物和PDCoV下游引物的浓度均为 1μM，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的浓度均为0.05μM，所述模板为猪的肠道内容物、粪便或肛门拭子提取的核酸RNA。
[0013]优选的，所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的5
’
端均使用 FAM荧光报告基团，3
’
端均使用MGB荧光淬灭基团。
[0014]本专利技术中，针对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV毒株，从NCBI GenBank 数据库中分别下载至少20条参考毒株的部分基因组序列进行对比与分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，包括iiPCR扩增液，所述iiPCR扩增液包括Taq DNA聚合酶、MMLV反转酶和引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对及第一探针、第二引物对及第二探针、第三引物对及第三探针、第四引物对及第四探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的PEDV上游引物和如SEQ ID NO.2所示的PEDV下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的PEDV探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的TGEV上游引物和如SEQ ID NO.5所示的TGEV下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6所示的TGEV探针，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.7所示的PoRV上游引物和如SEQ ID NO.8所示的PoRV下游引物，所述第三探针包括如SEQ ID NO.9所示的PoRV探针，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.10所示的PDCoV上游引物和如SEQ ID NO.11所示的PDCoV下游引物，所述第四探针包括如SEQ ID NO.12所示的PDCoV探针。2.根据权利要求1所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。3.根据权利要求2所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为进行灭活处理过的PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV病毒液，接毒剂量为1
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106TCID
50
/mL；阴性对照为Nuclease
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free水。4.根据权利要求1所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括待测样品。5.根据权利要求4所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述待测样品为猪的肠内...

【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，侯闻闻，余良政，朱振邦，刘盼娆，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：