快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒，包括PaMV引物，所述PaMV引物的序列为：PaMV

【技术实现步骤摘要】
快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于植物病毒检测
，涉及快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]百香果作为一种重要的经济作物，其加工产业包括饮料、果粉等衍生产品的利润较为丰厚，因此有大量农户种植百香果。但在种植百香果的过程中，病毒病很常见，给果农造成了很大的损失。毫不夸张的说，凡是有百香果种植的区域，基本上都有百香果病毒病的发生。
[0003]西番莲斑驳病毒(Passiflora mottle virus，PaMV)是影响百香果产量的病毒病之一。其主要的传播途径依靠带病苗、机械传播、嫁接传播及棉蚜、绣线菊蚜等，与其他病毒病一样，由病毒病的侵染而引起的作物减产是农业生产中的一个持久性问题，为了最大限度地减少病毒造成的损害，确保农业的可持续发展，探寻快速而精准的检测方法对控制这些植物病毒至关重要。
[0004]随着贸易全球化的发展，加剧了病毒及其宿主和载体的转移，这使得植物病毒检测技术变得更加重要。近年来，植物病毒检测技术发展很快，多种多样。包括生物学方法、血清学方法、电镜观察方法以及分子生物学方法中的核酸分子杂交技术、双链RNA电泳技术、聚合酶链式反应技术(PCR，RT
‑
PCR，实时荧光定量PCR，多重PCR，巢式PCR)、核酸序列扩增技术、环介导等温扩增技术等。这些方法通常不够快速和简便，不能满足农户快速、批量检测的要求。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术提供了快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒及方法，可以在田间实现短时、准确的批量检测PaMV病毒。
[0006]为了实现本专利技术的技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]本专利技术提供了快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒，包括PaMV引物，所述PaMV引物的序列为：
[0008]PaMV
‑
F 5
′‑
cagaatgcacaactcaacgagttgcagcagta
‑3′
，
[0009]PaMV
‑
R 5
′‑
gcttgtagtccaatagatggtccaaatccaag
‑3′
。
[0010]优选地，还包括PaMV探针，所述PaMV探针的序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46
‑
52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；探针共有四个修饰位点：距离5
′
端的≥35nt的中部位置标记一个dSpacer THF，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2
‑
4nt；THF距离3
′
末端≥15nt，并且3
′
末端标记一个修饰基团。
[0011]更优选地，所述修饰基团选自胺基、磷酸基团或C3
‑
Spacer。
[0012]优选地，所述PaMV探针的序列为：
[0013]aactatcaggacggatgcaatgag[FAM
‑
dT]c[THF]g[BHQ1
‑
dT]atcactccaatc[C3
‑
spacer]。
[0014]本专利技术还提供了快速检测百香果西番莲斑驳病毒的方法，包括：
[0015]1)向反应管中加入上游引物、下游引物、探针、RNase
‑
free水、核酸模板和缓冲液；
[0016]上游引物的序列为：5
′‑
cagaatgcacaactcaacgagttgcagcagta
‑3′
，
[0017]下游引物的序列为：5
′‑
gcttgtagtccaatagatggtccaaatccaag
‑3′
，
[0018]探针序列为：
[0019]aactatcaggacggatgcaatgag[FAM
‑
dT]c[THF]g[BHQ1
‑
dT]atcactccaatc[C3
‑
spacer]；
[0020]2)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中，恒温42℃，反应时间30min；
[0021]3)将反应后的产物至于荧光检测仪中。在阴性对照呈现无荧光，阳性对照呈现荧光的情况下，若样品呈现荧光，说明此样品存在PaMV病毒的感染；若样品无荧光，说明此样品不存在PaMV病毒的感染。
[0022]优选地，步骤1)中通过以下方法获取核酸模板：取5
‑
10g百香果新鲜的嫩叶置于1.5mL的离心管中，加入15
‑
25μL RNase free水，用研磨棒将其研磨至匀浆状，吸取2μL至新的离心管中并稀释至50μL作为核酸模板使用。
[0023]优选地，步骤1)每10μL反应体系中，加入0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.24μL探针、2.08μL RNase
‑
free水、0.5μL核酸模板和6.38μL缓冲液。
[0024]优选地，步骤1)中引物和探针浓度分别为10μM和5μM。
[0025]优选地，步骤3)中阴性对照的模板为RNase
‑
free水，阳性对照的模板为PaMV质粒。
[0026]本专利技术的有益效果在于：
[0027]本专利技术提供的快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒及方法，可以在田间实现短时、准确的批量检测PaMV病毒，操作方法简单易行，具有灵敏度高、特异性强、反应时间短(仅需30min)等特点，可以实现常温操作，常温反应以及常温保存，非常适合田间大规模快速检测。
附图说明
[0028]图1.MIRA法检测PaMV不同稀释倍数的荧光图。
[0029]图2.本专利技术检测PaMV特异性荧光图。
具体实施方式
[0030]为了更清楚地说明本专利技术，下面结合实施例并对照附图对本专利技术作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。
[0031]海南大学代谢实验室为了帮助农户解决田间快速鉴定百香果病毒病的问题，在全省进行调研，了解到PaMV病毒病在海南省百香果种植中分布较广，危害较重。针对PaMV病毒设计特异性引物，证实利用RNA恒温快速扩增荧光型试剂盒(MIRA)可以在田间实现短时、准确的批量检测PaMV病毒。以下检测试剂(如Abuffer、B buffer)来自RNA恒温快速扩增试剂
盒(荧光型)试剂盒(潍坊安普未来生物科技有限公司)。
[0032]实施例
[0033]一、MIRA法检测PaMV具体步骤：
[0034]1.引物设计：根据PaMV保守序列设计引物。
[0035本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒，包括PaMV引物，所述PaMV引物的序列为：PaMV
‑
F 5
′‑
cagaatgcacaactcaacgagttgcagcagta
‑3′
，PaMV
‑
R 5
′‑
gcttgtagtccaatagatggtccaaatccaag
‑3′
。2.根据权利要求1所述的快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒，其特征在于，还包括PaMV探针，所述PaMV探针的序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46
‑
52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；探针共有四个修饰位点：距离5
′
端的≥35nt的中部位置标记一个dSpacer THF，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2
‑
4nt；THF距离3
′
末端≥15nt，并且3
′
末端标记一个修饰基团。3.根据权利要求2所述的快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒，其特征在于，所述修饰基团选自胺基、磷酸基团或C3
‑
Spacer。4.根据权利要求2所述的快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒，其特征在于，所述PaMV探针的序列为：aactatcaggacggatgcaatgag[FAM
‑
dT]c[THF]g[BHQ1
‑
dT]atcactccaatc[C3
‑
spacer]。5.快速检测百香果西番莲斑驳病毒的方法，包括：1)向反应管中加入上游引物、下游引物、探针、RNase
‑
free水、核酸模板和缓冲液；上游引物的序列为：5
′‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：房传营，郭志宇，王玉慧，王瑞，李名扬，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：