基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其方法和应用，所述试剂盒包括特异性检测肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的引物和探针。本发明专利技术公开的噬菌体生物扩增法结合双重实时荧光定量PCR同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒可特异性检测活的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，检测限均低至101CFU/mL，并且可以区分死活菌。与传统培养法相比，检测时间大大缩短，4h内完成样品的检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其方法和应用


[0001]本专利技术涉及食品安全领域，具体涉及一种基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其方法和应用。

技术介绍

[0002]沙门氏菌是世界上最常见的食源性病原体之一，有的专对人类致病，有的只对动物致病，有的对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽所产生的不同形式疾病的总称。据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌作为主要的食源性病原体之一，每年造成数十万人死亡。2015年欧洲报告了94625例沙门氏菌病，约占欧洲所有食源性疾病报告的28％，比2014年增加了1.9％；此外，10个会员国报告了126例死亡病例。在美国，沙门氏菌造成的年经济损失超过30亿美元，这还不包括未报告的病例。此前的研究报告称，受污染的动物源性食品或新鲜农产品可能是沙门氏菌感染的来源。摄入受污染的食物，如牛肉、家禽、牛奶、鸡蛋或蔬菜，会导致沙门氏菌病。沙门氏菌病的症状包括摄入受污染食物后12至72h的腹泻，发烧和腹部痉挛，持续4
‑
7d。有时，感染沙门氏菌的患者可能会在后期发展为Reiter综合征，其中包括关节频繁疼痛，眼睛刺激和排尿疼痛，甚至有些患者会发生菌血症、败血症而死亡。
[0003]金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌之一，在自然环境中广泛存在。金黄色葡萄球菌在适当的条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌的第三大微生物致病菌。金黄色葡萄球菌导致的食物中毒究其原因是食物沾染了金黄色葡萄球菌产生的肠毒素引起的。金黄色葡萄球菌致病力的强弱跟所产生的毒素和侵袭性酶有所关联。金黄色葡萄球菌污染牛奶及奶制品、肉类、蛋类等水分和淀粉含量较多的食品时，在合适的温度下，8
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10h内就会产生大量的肠毒素，且100℃下加热30min也不会被破坏，随被污染的食物进入人体后引起食物中毒，导致严重的呕吐、腹泻等症状。根据全国各地的调查研究报道，生肉、牛奶及奶制品、速冻食品、熟食等是金黄色葡萄球菌污染的重灾区。根据美国疾病控制中心相关报告，1983
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1997年间，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件平均18.5万人/年，损失高达15亿美元。2000年，日本雪印奶粉事件中，肠毒素导致超过1.4万人食物中毒。因此，对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行准确快速检测具有重要意义。
[0004]传统培养法简单易操作，结果准确，但其花费的时间较长，实验过程较为繁琐，已经不能满足当前对食源性病原菌快速检测的要求。噬菌体分布广泛，分离方法简单，价格便宜，对宿主菌具有特异性，具有广泛的应用前景。噬菌体生物扩增法(Phage Amplification Assay，PAA)是基于烈性噬菌体裂解宿主菌产生子代噬菌体，在培养基上形成噬菌斑，从而实现对宿主菌进行间接检测的一种方法。该方法操作简单快速，灵敏度高，成本低廉，特别
2020562，于2020年9月29日将该噬菌体LSA2311保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2020562，保藏日期为：2020年9月29日。在申请号为2020112108493、专利技术名称为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311及其应用的中国专利技术专利公开。
[0019]进一步地，所述试剂盒还包括含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液、含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液、阴性对照品、阳性对照品、硫酸亚铁铵溶液和柠檬酸三钠溶液。
[0020]再进一步地，所述含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液中肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37效价为107PFU/mL，所述含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液中金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311效价为108PFU/mL；阴性对照品：灭菌超纯水；
[0021]阳性对照品为肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，分别为肠炎沙门氏菌ATCC 13076、金黄色葡萄球菌ATCC 25923；
[0022]硫酸亚铁铵溶液浓度为30mM；
[0023]柠檬酸三钠溶液为20mM。
[0024]本专利技术还提供了一种利用上述快速检测试剂盒同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
[0025]1)双重噬菌体生物扩增法检测
[0026]a.将含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液和含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液混合，得到混合悬液，然后混合悬液与前处理的待检测样品混合，培养，得到培养物；
[0027]b.将培养物与硫酸亚铁铵溶液混合，并加入LB液体培养基培养；然后加入柠檬酸三纳溶液，得到混合液；
[0028]c.将混合液离心，得到上清液，即为肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的混合子代噬菌体；
[0029]2)子代噬菌体的双重实时荧光定量PCR检测：
[0030]a.热裂解法提取混合子代噬菌体的DNA，并保存于
‑
20℃；
[0031]b.以混合子代噬菌体的DNA为模板，利用检测肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的两对引物和探针进行实时荧光定量PCR得到PCR产物，其中，两对引物对和探针分别为：
[0032]SEP37
‑
F：5
’‑
TCCGTACCTTGGCAGAAACTT
‑3’
；
[0033]SEP37
‑
R：5
’‑
GTACGGTCACCAGCTAAGTTGA
‑3’
；
[0034]SEP37
‑
Probe：5
’‑
FAM
‑
AAGCTGCTCCAATGCCCGCTGGTATCG
‑
BHQ1
‑3’
；
[0035]LSA2311
‑
F：5
’‑
TGATAAGACAGGTGAAATGTACCAAGT
‑3’
；
[0036]LSA2311
‑
R：5
’‑
CCGTTGCCTTTATCATATAGTTCTTTAA
‑3’
；
[0037]LSA2311
‑
Probe：
[0038]5’‑
HEX
‑
TAAACGCAGAGGAGACGACCATTACGCAC
‑
BHQ2
‑3’
；
[0039]c.qPCR产物的Ct值与标准曲线分析得到待检测的样品中是否含有沙门氏菌和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性检测肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的引物和探针，具体序列如下：SEP37
‑
F：5
’‑
TCCGTACCTTGGCAGAAACTT
‑3’
；SEP37
‑
R：5
’‑
GTACGGTCACCAGCTAAGTTGA
‑3’
；SEP37
‑
Probe：5
’‑
FAM
‑
AAGCTGCTCCAATGCCCGCTGGTATCG
‑
BHQ1
‑3’
；LSA2311
‑
F：5
’‑
TGATAAGACAGGTGAAATGTACCAAGT
‑3’
；LSA2311
‑
R：5
’‑
CCGTTGCCTTTATCATATAGTTCTTTAA
‑3’
；LSA2311
‑
Probe：5
’‑
HEX
‑
TAAACGCAGAGGAGACGACCATTACGCAC
‑
BHQ2
‑3’
。2.根据权利要求1所述基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液、含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液、阴性对照品、阳性对照品、硫酸亚铁铵溶液和柠檬酸三钠溶液。3.根据权利要求2所述基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液中肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37效价为107PFU/mL，所述含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液中金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311效价为108PFU/mL；阴性对照品：灭菌超纯水；阳性对照品为肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，分别为肠炎沙门氏菌ATCC 13076、金黄色葡萄球菌ATCC 25923；硫酸亚铁铵溶液浓度为30mM；柠檬酸三钠溶液为20mM。4.一种利用权利要求1所述快速检测试剂盒同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)双重噬菌体生物扩增法检测a.将含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液和含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液混合，得到混合悬液，然后混合悬液与前处理的待检测样品混合，培养，得到培养物；b.将培养物与硫酸亚铁铵溶液混合，并加入LB液体培养基培养；然后加入柠檬酸三纳溶液，得到混合液；c.将混合液离心，得到上清液，即为肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小红，郑然静，丁一峰，黄晨曦，王佳，邵彦春，王源上，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：