一种基于双重NanoPCR检测SVA和EMCV的引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于双重NanoPCR检测SVA和EMCV的引物组、试剂盒及其应用，属于病毒检测技术领域。本发明专利技术提供的双重NanoPCR检测SVA和EMCV的引物，包括塞内卡病毒A检测引物SVAF/SVA R和脑心肌炎病毒检测引物EMCV F/EMCV R。本发明专利技术所述方法特异性强、灵敏度高、操作简便。作简便。作简便。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双重NanoPCR检测SVA和EMCV的引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种基于双重NanoPCR检测SVA和EMCV的引物组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是小核糖核酸病毒科、塞内卡病毒属唯一成员，又称为塞尼卡谷病毒。近年来的众多研究都表明SVA与猪原发性水疱病和新生仔猪死亡率升高密切相关，感染SVA的患猪表现出厌食、发热、跛行等症状，口腔黏膜、鼻等出现完整或破裂的小泡，蹄壁以及冠状带出现溃疡性病变，感染SVA的新生仔猪死亡率显著增加。SVA可以感染所有日龄的猪，且没有明显的季节性，四季皆可发生，以春秋多发。目前该病大多为散发。猪是本病毒的宿主。老鼠和苍蝇是重要的病毒携带者，在病毒的传播过程中起到重要的作用。
[0003]脑心肌炎(Encephalomyocarditis,EMC)是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的一种以脑炎、心肌炎和繁殖障碍为主要临诊特征的人畜共患传染病。自然条件下，EMCV可以感染家畜、啮齿类动物、野生动物以及灵长类动物，其中啮齿类动物是其自然储存宿主和主要传播者。猪是被该病毒感染和危害最严重的家畜，妊娠母猪感染后可致流产、产死胎和弱仔，仔猪感染后可致致死性心肌炎和脑炎等。
[0004]目前，针对SVA或EMCV国内外已建立多种检测方法，SVA的基因组特征与心病毒属的成员非常相似。有学者对SVA和EMCV保守多肽区分析发现，SVA的P1、2C、3C和3D多肽与心病毒属的P1、2C、3C和3D多肽的遗传关系最为密切，这2种病毒在临床上也不排除有混合感染的可能性。因此，同时检测SVA和EMCV对于早期疾病诊断是非常的必要。
[0005]然而，目前还未有关于同于检测SVA和EMCV技术的报道，严重制约了猪养殖业的健康发展。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于双重NanoPCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的引物组、试剂盒及其应用。
[0007]本专利技术提供了一种基于双重Nano PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的引物组，包括塞内卡病毒A检测引物SVAF/SVAR和脑心肌炎病毒检测引物EMCVF/EMCV R；
[0008]所述SVAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0009]所述SVAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0010]所述EMCVF的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0011]所述EMCV R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0012]本专利技术提供了所述引物组在制备同时检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的试剂盒
中的应用。
[0013]本专利技术提供了一种基于双重PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的试剂盒，包括所述引物组。
[0014]优选的，所述试剂盒还包括2
×
Taq PCRMasterMix和金纳米颗粒。
[0015]优选的，所述试剂盒还包括病毒RNA提取试剂和反转录试剂。
[0016]本专利技术提供了所述引物组或所述试剂盒在非诊断目的的检测塞内卡病毒A和/或脑心肌炎病毒中的应用。
[0017]本专利技术提供了一种非诊断目的的检测塞内卡病毒A和/或脑心肌炎病毒的方法，包括以下步骤：
[0018]1)提取样本RNA；
[0019]2)将步骤1)中提取的样本RNA经反转录，得到cDNA；
[0020]3)以步骤2)中所述cDNA为模板，以所述引物组进行双重Nano PCR检测，得到PCR产物；
[0021]4)将步骤3)中所述PCR产物进行条带分析，根据是否出现预期的条带判断样本是否塞内卡病毒A和/或脑心肌炎病毒。
[0022]优选的，步骤2)中所述双重Nano PCR检测的反应体系为25μL：10μmol/L SVA F和10μmol/L SVA R各1.25μL，10μmol/L EMCV F和10μmol/L EMCV R各1.25μL，2
×
Taq PCR MasterMix 12.5μL、0.05mg/mL金纳米颗粒0.5μL、病毒cDNA2μL和水5μL。
[0023]优选的，步骤2)中所述双重Nano PCR检测的反应程序为95℃3min；95℃30s，50.4℃30s，72℃，25s，30个循环；72℃5min。
[0024]优选的，所述样本中含塞内卡病毒A的拷贝数不低于9.45
×
103copies/μL；
[0025]所述样本中含脑心肌炎病毒的拷贝数不低于8.77
×
103copies/μL。
[0026]本专利技术提供了基于双重Nano PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的引物组，包括塞内卡病毒A检测引物SVAF/SVAR和脑心肌炎病毒检测引物EMCVF/EMCV R；所述SVAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述SVAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述EMCV F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述EMCV R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。利用本专利技术所述引物组能够实现塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的双重检测，能够为进一步研究上述两种病毒流行情况作技术上的有力支持，为兽医临床大规模的流行病学调查的技术手段。本方法所述引物特异性强，后续使用时无非特异性扩增，具有可重复性，在灵敏度上高于双重RT
‑
PCR技术，应用于临床检测，吻合率与单重RT
‑
PCR一致，具有临床可靠性。
附图说明
[0027]图1为本专利技术提供的SVA最佳退火温度图；
[0028]图2为本专利技术提供的EMCV最佳退火温度图；
[0029]图3为本专利技术提供的SVA\EMCV重组质粒PCR鉴定；
[0030]图4为本专利技术提供的SVA测序比对结果；
[0031]图5为本专利技术提供的EMCV测序比对结果；
[0032]图6为本专利技术提供的SVA单一PCR灵敏度实验；
[0033]图7为本专利技术提供的EMCV单一PCR灵敏度实验；
[0034]图8为本专利技术提供的双重RT
‑
PCR方法退火温度优化结果；
[0035]图9、图10为本专利技术提供的双重RT
‑
PCR的引物浓度的优化结果；
[0036]图11为本专利技术提供的双重NanoPCR方法的金纳米颗粒浓度的优化结果；
[0037]图12为本专利技术提供的双重RT
‑
PCR方法的灵敏度验证结果；
[0038]图13为本专利技术提供的双重NanoPCR方法的灵敏度验证结果；
[0039]图14为本专利技术提供的双重NanoPCR方法特异性验证结果；
[0040]图15为本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双重Nano PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的引物组，其特征在于，包括塞内卡病毒A检测引物SVAF/SVAR和脑心肌炎病毒检测引物EMCVF/EMCV R；所述SVAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述SVAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述EMCVF的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述EMCV R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.权利要求1所述引物组在制备同时检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的试剂盒中的应用。3.一种基于双重PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2
×
Taq PCRMasterMix和金纳米颗粒。5.根据权利要求3或4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括病毒RNA提取试剂和反转录试剂。6.权利要求1所述引物组或权利要求2～5任意一项所述试剂盒在非诊断目的的检测塞内卡病毒A和/或脑心肌炎病毒中的应用。7.一种非诊断目的的检测塞内卡病毒A和/或脑心肌炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样本RNA；2)将步骤1)中提取的样本RNA经反转录，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亮，孙裴，李杰，秦娟，陈丽君，高亚飞，杨勇，蒋广志，何长生，王军，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：