褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其是褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用。本发明专利技术通过克隆褐黄孢链霉菌纳他霉素生物合成基因簇中的启动子groESp以及来自大肠杆菌基因组的乙酰辅酶A羧化酶基因accA,成功构建了表达载体pSET152

【技术实现步骤摘要】
褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其是褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与 应用。

技术介绍

[0002]纳他霉素(Natamycin)是一种天然、高效、光谱的抗真菌剂，在较低剂量下即 可有效抑制酵母菌和霉菌的生长，达到理想的防腐效果。相比于人工的防腐剂，纳 他霉素具有水中溶解度低的特点，使其可应用于食品表面的防腐，且不影响食品本 身的风味和口感。1982年，美国FDA正式批准纳他霉素作为食品防腐剂在食品中 应用。1997年，纳他霉素作为防腐剂应用于食品行业在我国液得到正式批准。目 前，纳他霉素在乳制品、肉制品、果汁饮料等食品的生产和保藏中得到广泛应用， 正式批准应用的国家也多达50多个。
[0003]目前纳他霉素的产量偏低，通过研究发现groESp启动子在初级代谢中活性低 而在次级代谢中活性高，从而能够保证使用该启动子时，不影响链霉菌的初级代谢， 而在次级代谢中保证相关产物的高效产出。乙酰辅酶A羧化酶基因accA可以促进 乙酰辅酶A向丙酰辅酶A转化，从而为纳他霉素生物合成提供更多短链脂肪酸。 若通过该基因的表达得到工程菌株，能大幅度提高纳他霉素的产量。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的上述不足，本专利技术提供一种褐黄孢链霉菌重组表达质粒及 工程菌与应用，通过克隆褐黄孢链霉菌纳他霉素生物合成基因簇中的启动子 groESp以及来自大肠杆菌基因组的乙酰辅酶A羧化酶基因accA,成功构建了表 达载体pSET152
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groESp
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accA；通过带有表达载体pSET152
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groESp
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accA的大 肠杆菌ET12567(pUZ8002)与褐黄孢链霉菌的结合转移实验获得了褐黄孢链霉 菌工程菌株，提高纳他霉素的生物合成产量。
[0005]一方面，本专利技术提供一种褐黄孢链霉菌重组表达质粒，由groESp启动子和乙 酰辅酶A羧化酶基因accA插入pSET152载体，构建重组表达载体 pSET152
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groESp
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accA。
[0006]另一方面，本专利技术提供一种含有上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌， 其制备步骤如下：将含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的大肠杆菌与褐黄孢 链霉菌孢子混合，菌液均匀涂布在含有MS培养基上，培养13～20h，之后涂布 ddH2O，继续培养3
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5天即可筛选出含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的工 程菌。
[0007]本方案进一步改进，将含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的大肠杆菌与 褐黄孢链霉菌孢子按1：1混合，菌液均匀涂布在含有10mM MgCL2的MS培养基 上，29℃培养13～20h，之后涂布1mLddH2O(含有50ug/mL～100ug/mL萘啶酮酸和 50ug/mL安普霉素)，29℃继续培养3
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5天即可筛选出含有重组表达载体 pSET152
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groESp
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accA的工程。
[0008]另一方面，本专利技术还提供上述工程菌生产纳他霉素的应用。
[0009]生产纳他霉素具体制备方法如下：制备新鲜孢子悬液，按2％
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4％的接种量接 种于种子培养基，29℃、200rpm培养2d，种子培养基按5％的接种量转接到到发 酵培养基中29
℃、200rpm发酵培养。
[0010]其中种子培养基按g/L计为：葡萄糖为25，蛋白胨为5，NaCl为10，pH＝7.0。
[0011]发酵培养基按g/L计为：葡萄糖为45，大豆蛋白胨为10，pH＝7.5。
[0012]本专利技术的有益效果在于：
[0013](1)本专利技术通过克隆褐黄孢链霉菌纳他霉素生物合成基因簇中的启动子 groESp以及来自大肠杆菌基因组的乙酰辅酶A羧化酶基因accA,成功构建了表达载 体pSET152
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groESp
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accA；通过带有表达载体pSET152
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groESp
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accA的大肠杆菌 ET12567(pUZ8002)与褐黄孢链霉菌的结合转移实验获得了褐黄孢链霉菌工程菌株； 褐黄孢链霉菌工程菌株因纳他霉素生物合成基因簇中的groESp启动子是一种更高 效的启动子，groESp的活性在初级代谢中较弱，但在次级代谢中比现有链霉菌启 动子活性高，有利于菌株的生长和纳他霉素的合成。乙酰辅酶A羧化酶基因accA 可以促进乙酰辅酶A向丙酰辅酶A转化，从而为纳他霉素生物合成提供更多短链 脂肪酸，groESp启动子和乙酰辅酶A羧化酶基因accA的叠加效应，进一步提高纳 他霉素的生物合成。
[0014](2)本专利技术以groESp启动子为基础构建了基因工程菌株，实现了在次级代谢 过程中菌体生长和目的产物纳他霉素合成的同步进行，保证了碳通量更多的在次级 代谢中被利用，大大提高了纳他霉素的产量，单位发酵产量由原来的10g/L提高到 13.5g/L。
具体实施方式
[0015]为了使本
的人员更好地理解本专利技术中的技术方案，下面将对本发 明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是 本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域 普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当 属于本专利技术保护的范围。
[0016]实施例1
[0017]一种褐黄孢链霉菌重组表达质粒，由groESp启动子和乙酰辅酶A羧化酶基因 accA插入pSET152载体，构建重组表达载体pSET152
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groESp
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accA。
[0018]实施例2
[0019]一种上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌，制备步骤如下：
[0020]将含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的大肠杆菌与褐黄孢链霉菌孢子 按1：1混合，菌液均匀涂布在含有8mM MgCL2的MS培养基上，25℃培养13h， 之后涂布1mLddH2O(含有50ug/mL～100ug/mL萘啶酮酸和50ug/mL安普霉素)， 25℃继续培养3天即可筛选出含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的工程。
[0021]实施例3
[0022]与实施例2不同在于，一种上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌，制备步 骤如下：
[0023]将含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的大肠杆菌与褐黄孢链霉菌孢子 按2：1混合，菌液均本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐黄孢链霉菌重组表达质粒，其特征在于：由groESp启动子和乙酰辅酶A羧化酶基因accA插入pSET152载体，构建重组表达载体pSET152
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groESp
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accA。2.一种含有权利要求1所述褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌。3.根据权利要求2所述的含有褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌，其特征在于：将含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的大肠杆菌与褐黄孢链霉菌孢子混合，菌液均匀涂布在含有MS的培养基上，培养13～20h，之后涂布ddH2O，继续培养3
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5天即可筛选出含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的工程菌。4.根据权利要求3所述的含有褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌，其特征在于：将含有重组表达载体pSET152
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groESp
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accA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海军，徐波，唐双焱，张英华，王兆兰，李艳艳，王超，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：