基因组连续整合系统、应用及方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基因组连续整合系统，所述系统为重组工程菌株，该重组工程菌株是利用重组选择性标记基因，且重组选择性标记内部含有位点特异性重组酶识别位点，来实现外源基因/簇的连续整合入宿主基因组，来构建得到的。本发明专利技术系统不受选择性标记数目的限制，可以连续多次使用，方便构建包含任意拷贝数的目标基因(簇)的工程菌株。采用本发明专利技术系统构建的工程菌株只包含有一个功能性抗性基因，方便后续的其它定向遗传改造。其它定向遗传改造。其它定向遗传改造。

【技术实现步骤摘要】
基因组连续整合系统、应用及方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是一种基因组连续整合系统、应用及方法。

技术介绍

[0002]代谢工程与合成生物学研究中经常需要在宿主基因组上引入多酶途径或者引入编码途径的多个拷贝，以实现相关基因的稳定表达和高效表达。比如在模式生物酵母菌中，通过Di
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CRISPR(delta integration CRISPR
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Cas)方法可以一步实现目标基因的多拷贝、无标记整合(Metabolic Engineering 33(2016):19
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27)。该方法的成功依赖于宿主具有的高效同源重组系统。而对于链霉菌等其它工业菌株，同源重组效率低，采用类似的策略实现目标基因(簇)在基因组上的整合和多拷贝化十分具有挑战性。Li Lei等人通过引入噬菌体来源的位点特异性重组系统，可以在链霉菌中实现目标基因(簇)的多拷贝整合或者连续整合(Metabolic Engineering 52(2019)153
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167)，但是通过该方法构建重组工程菌时，由于选择标记基因数量和整合酶种类的限制，最多可以进行5次整合(实现5个拷贝)，并且获得的工程菌株同时存在多个拷贝的抗性基因，这给后续的遗传改造带来了不便。因此，在链霉菌等内源同源重组效率低的工业菌中，一种不受遗传标记数量和整合酶种类限制的基因组高效连续整合系统对于代谢工程改造和合成生物学研究具有极大的应用价值。
[0003]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因组连续整合系统、应用及方法。
[0005]本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种基因组连续整合系统，所述系统为重组工程菌株，该重组工程菌株是利用重组选择性标记基因，且重组选择性标记内部含有位点特异性重组酶识别位点，来实现外源基因/簇的连续整合入宿主基因组，来构建得到的。
[0007]一种基因组连续整合系统，所述系统包含两个质粒载体pINT01和pINT02。
[0008]进一步地，所述载体pINT01包含有重组安普霉素抗性基因aprB10和attP整合位点；aprB10是在安普霉素抗性基因acc(3)IV第62、82、166、218个密码子后同框插入了attB10反向序列(GCTGGATCATCTGGATCTATTTCGTCAAAAACCTGG)所获得，基因aprB10的序列为SEQ ID NO.1。
[0009]进一步地，所述载体pINT01的构建步骤如下：
[0010]将序列为SEQ ID NO.1的基因aprB10替代质粒pIJ10500中的潮霉素抗性基因aph，获得重组质粒pINT01。
[0011]进一步地，所述载体pINT02包含有重组潮霉素抗性基因hygB和attP10整合位点；hygB是在潮霉素抗性基因aph第123、135、168、215个密码子后插入attB反向互补序列(GCTGGATCATCTGGATCACTTTCGTCAAAAACCTGG)获得的重组基因，能够作为潮霉素抗性标记基因使
用，基因hygB的序列为SEQ ID NO.2。
[0012]进一步地，所述载体pINT02构建步骤如下：
[0013]将质粒pIJ10500中引入attP10序列，消除attP位点和ΦBT1整合酶编码基因，并将潮霉素抗性基因aph替换为序列为SEQ ID NO.2的重组潮霉素抗性基因hygB，最终获得重组质粒pINT02。
[0014]如上所述的基因组连续整合系统在构建包含任意拷贝数的目标基因/簇的工程菌株方面中的应用。
[0015]如上所述的基因组连续整合系统在将外源基因连续导入宿主基因组方面中的应用。
[0016]利用如上所述的系统的高效基因组连续整合方法，其特征在于：步骤如下：
[0017]通过交替使用两个质粒载体pINT01和pINT02，将不同外源基因/簇连续导入目标菌株，或将同一基因/簇连续导入宿主菌，实现基因簇的多拷贝化。
[0018]本专利技术取得的有益效果是：
[0019]1、本专利技术系统不受选择性标记数目的限制，可以连续多次使用，方便构建包含任意拷贝数的目标基因(簇)的工程菌株。采用本专利技术系统构建的工程菌株只包含有一个功能性抗性基因，方便后续的其它定向遗传改造。
[0020]2、本专利技术设计并筛选到了两个含有不同类型的细菌整合位点的抗性基因(aprB10，hygB)，以此为基础构建了两个链霉菌整合型载体pINT01和pINT02。采用ΦBT1整合酶高效催化不同组合的整合位点(attP/attB,attP10/attB10)之间遗传重组的特点，通过交替使用两个整合型载体(pINT01和pINT02)，可以将不同外源基因(簇)连续导入目标菌株，或将同一基因(簇)连续导入宿主菌实现基因簇的多拷贝化。该方法不需要额外的选择性标记基因，无需单独的抗性基因消除的步骤，节约了构建时间；采用本专利技术构建成功的工程菌株只包含有一个功能性抗性基因，方便后续的其它定向遗传改造。最后，采用本专利技术技术可以方便构建包含任意拷贝数的目标基因(簇)的工程菌株。
[0021]3、本专利技术提供了一种高效的基因组连续整合方法，利用该方法可以不限次数地将目标基因(簇)在基因组上进行连续整合，构建成包含任意拷贝数的目标基因(簇)的工程菌株；另外该过程没有单独的遗传标记消除步骤，大大节约了重组菌株构建周期。
[0022]4、来源于链霉菌噬菌体ΦBT1的整合酶(Int)属于丝氨酸整合酶家族，该酶能够高效催化噬菌体整合位点序列(attP)与细菌整合位点序列(attB)之间发生重组，生成attL和attR序列(图.1a)。除了野生型整合位点(attP/attB),ΦBT1整合酶还能够催化多对突变型的整合位点(attP01/attB01
……
attP15/attB15)之间发生重组(图.1bc)，该重组过程无需其它组分参与，且是单向的(Journal ofMolecular Cell Biology(2010),2,264
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275)。基于上述现象，本专利技术的设计思路如下，首先筛选获得两种新型选择性标记基因aprB10和hygB，前者是安普霉素抗性基因，在编码框内含有整合位点attB10，后者是潮霉素抗性基因，在编码框内含有野生型整合位点attB。采用这两个重组抗性基因，构建了两个质粒载体，pINT01和pINT02,二者都包含大肠杆菌复制元件(ori)和结合转移元件oriT；pINT01还包含ΦBT1的整合酶编码基因，选择性标记基因aprB10和attP整合位点；pINT02还包含选择性标记基因hygB和整合位点attP10。以pINT01和pINT02为载体，实现目的基因(簇)在宿主中连续整合的流程如图2所示：首先将待整合基因(簇)分别克隆到pINT01和pINT02载体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因组连续整合系统，其特征在于：所述系统为重组工程菌株，该重组工程菌株是利用重组选择性标记基因，且重组选择性标记内部含有位点特异性重组酶识别位点，来实现外源基因/簇的连续整合入宿主基因组，来构建得到的。2.一种基因组连续整合系统，其特征在于：所述系统包含两个质粒载体pINT01和pINT02。3.根据权利要求2所述的基因组连续整合系统，其特征在于：所述载体pINT01包含有重组安普霉素抗性基因aprB10和attP整合位点；aprB10是在安普霉素抗性基因acc(3)IV第62、82、166、218个密码子后同框插入了attB10反向序列所获得，基因aprB10的序列为SEQ ID NO.1。4.根据权利要求2所述的基因组连续整合系统，其特征在于：所述载体pINT01的构建步骤如下：将序列为SEQ ID NO.1的基因aprB10替代质粒pIJ10500中的潮霉素抗性基因aph，获得重组质粒pINT01。5.根据权利要求2所述的基因组连续整合系统，其特征在于：所述载体pINT02包含有重组潮霉素抗性基因hygB和attP1...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢周杰，刘浩，许璐，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：