含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒制造技术

本发明专利技术涉及含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒，包括：诱导型启动子为tfd

【技术实现步骤摘要】
含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒。

技术介绍

[0002]放线菌(Actinomycete)是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70％是各种放线菌所产生，有些种类的放线菌还能产生各种酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等)、维生素(B12)和有机酸等。但相对低效的基因操作方法极大地阻碍了这些生物体天然产物的代谢工程。传统放线菌基因敲除方法受抗性筛选标记的限制不能实现基因编辑的无痕操作，标记性基因的残留为进一步研究以及应用带来不可控的影响。因此，提供适合放线菌的无痕基因操作的质粒尤为必要。

技术实现思路

[0003]鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒，利用MazE
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MazF细菌毒素
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抗毒素系统构建可用于放线菌基因敲除、大片段敲除、定点突变、基因插入、大片段插入等多种编辑的高效无痕基因编辑质粒，为放线菌来源的天然产物开发提供高效工具。
[0004]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0005]含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒，包括：诱导型启动子为tfd
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otrR
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Ptor
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、密码子优化的抗毒素基因mazE、密码子优化的毒素基因mazF、弱强度组成型启动子Psco4508、终止子和携带安普霉素基因的骨架；诱导型启动子为tfd
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otrR
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Ptor
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诱导密码子优化的抗毒素基因mazE表达，弱强度组成型启动子Psco4508控制密码子优化的毒素基因mazF的表达。
[0006]采用上述方案的有益效果：
[0007]本专利技术提供将由同一个启动子控制的毒素
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抗毒素mazEF系统改变表达调控方式：即由诱导型启动子诱导表达抗毒素MazE，组成型启动子持续表达毒素MazF，构建抗毒素开关调节的毒素反筛盒(toxin counter
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selectation
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cassette regulated by an antitoxin switch,TCRAS)。正常条件下添加诱导剂，抗毒素毒素MazE能够中和毒素MazF毒性；在反筛条件下，不加诱导剂，自由的MazF在RNA的ACA位点切割单链RNA，组织蛋白翻译，导致含有TARAS系统的细胞死亡，而经过同源重组删除的TARAS的细胞受影响，正常生长，实现反筛。
[0008]毒素基因mazF的表达在筛选过程中至关重要，选用弱启动子Psco4508，可以使毒素基因mazF的表达满足放线菌的无痕编辑的需求。
[0009]进一步，诱导型启动子为tfd
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otrR
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Ptor
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的序列包括SEQ ID NO:1所示的序列；密码子优化的抗毒素基因mazE的序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；密码子优化的毒素基因
mazF的序列包括SEQ ID NO:3所示的序列；弱强度组成型启动子Psco4508的序列包括SEQ ID NO:4所示的序列；终止子的序列包括SEQ ID NO:5所示的序列。
[0010]进一步，质粒的序列包括SEQ ID NO:6所示的序列。
[0011]采用上述方案的有益效果：采用上述的序列可以保证正筛反筛的效果，从而实现放线菌的基因编辑操作。
[0012]本专利技术提供一种用于无痕编辑的菌株，包括上述的质粒。
[0013]采用上述方案的有益效果：菌株便于扩增培养，使质粒便于保存。
[0014]本专利技术还提供上述质粒在放线菌基因无痕编辑中的应用，从而满足放线菌基因无痕编辑的需求，例如：基因或片段敲除、替换、插入或定点突变。
[0015]本专利技术提供一种放线菌基因无痕编辑的方法，包括以下步骤：
[0016](1)将同源臂连接到上述质粒，获得无痕基因编辑质粒，无痕基因编辑质粒含有安普霉素抗性基因Apr；
[0017](2)将无痕基因编辑质粒转化大肠杆菌ETZ12567菌株，与放线菌共培养，通过接合转移将质粒转移至放线菌，并在含有安普霉素和诱导剂的平板上筛选转化子；
[0018](3)转化子再培养和反向筛选正向筛选：将步骤(2)得到的转化子在含有诱导剂、不含安普霉素的培养基上进行培养，然后将细胞稀释涂布于不含安普霉素、不含诱导剂的平板上培养，只有发生二次重组，将TCRAS系统删除的细胞才会生长形成单菌落；
[0019](4)将上一步的单菌落进行鉴定，得到基因无痕编辑的放线菌。
[0020]进一步，所述同源臂为含有待基因编辑的靶序列区上游同源臂和下游同源臂的PCR片段。例如：所述同源臂为含有待敲除靶序列区上游同源臂、下游同源臂的PCR片段；所述同源臂为含有待替换的靶序列区上游同源臂、下游同源臂的PCR片段；所述同源臂为含有待插入的靶序列区上游同源臂、下游同源臂的PCR片段；所述同源臂为含有待点突变的靶序列区上游同源臂、下游同源臂的PCR片段。
[0021]采用上述方案的有益效果：采用上述方案，可以实现基因的无痕编辑操作，不会残留标记性基因，不会对后续的菌株的研究以及应用产生影响，并且具有高效的优点。
[0022]本专利技术提供一种含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒的构建方法，包括以下步骤：使用组成型启动子Psco4508组成型表达毒素蛋白基因mazF，利用氧四环素诱导型启动子Ptor*诱导表达抗毒素蛋白基因mazE，将上述片段和PKC1139质粒经过BamHI/EoRI酶切后，连接在一起，得到适合于放线菌无痕基因编辑的遗传操作质粒pZY026。
[0023]采用上述方案的有益效果：采用上述方法构建的质粒，可以用于基因的无痕编辑操作，不会残留标记性基因，不会对后续的菌株的研究以及应用产生影响，为放线菌来源的天然产物开发提供工具，具有高效的优点。
附图说明
[0024]图1为质粒构建原理示意图。
[0025]图2为MazEF TCRAS系统构建框架。
[0026]图3为pZY026质粒图谱。
[0027]图4为tfd
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ortR
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Ptor*片段、mazE
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mazF、Psco4508启动子的扩增结果。
[0028]图5为tfd
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otrR
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Ptor*
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mazE
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mazF
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Psco4508片段扩增结果。
[0029]图6为pZY026酶切验证的结果。
[0030]图7为利用质粒pZY026进行无痕基因敲除的方法示意图。
[0031]图8为利用质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒，其特征在于，包括：诱导型启动子为tfd
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otrR
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Ptor
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、密码子优化的抗毒素基因mazE、弱强度组成型启动子Psco4508、密码子优化的毒素基因mazF终止子和携带安普霉素基因的骨架；诱导型启动子为tfd
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otrR
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Ptor
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诱导密码子优化的抗毒素基因mazE表达，弱强度组成型启动子Psco4508控制密码子优化的毒素基因mazF的表达。2.根据权利要求1所述质粒，其特征在于，诱导型启动子为tfd
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otrR
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Ptor
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的序列包括SEQ ID NO:1所示的序列；密码子优化的抗毒素基因mazE的序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；密码子优化的毒素基因mazF的序列包括SEQ ID NO:3所示的序列；弱强度组成型启动子Psco4508的序列包括SEQ ID NO:4所示的序列；终止子的序列包括SEQ ID NO:5所示的序列。3.根据权利要求1或2所述质粒，其特征在于，质粒的序列包括SEQ ID NO:6所示的序列。4.一种用于无痕编辑的菌株，其特征在于，包括权利要求1
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3任一项所述的质粒。5.权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴杰，曲璟秋，江晋渝，程晓菊，付于银，
申请(专利权)人：遵义市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：