本发明专利技术公开了一种提高大环内酯抗生素产量的重组载体和重组菌与应用,属于基因工程领域。本发明专利技术的目的是为了提高大环内酯类抗生素的得率和效价。一种用于大环内酯类抗生素外排的重组载体,所述重组载体的出发载体为pSET152T,以冰城链霉菌BC
【技术实现步骤摘要】
avermitilis)或蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)为出发菌,将所述的重组载体导入到出发菌中得到的重组菌株。
[0007]进一步地限定,所述启动子序列如SEQ ID NO:48所示,所述外排基因的序列为SEQ ID NO:14所示。本专利技术还提供一种含有上述提高大环内酯抗生素产量的重组载体的重组菌株,所述重组菌株是以工业化冰城链霉菌、冰城链霉菌野生型、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)或蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)为出发菌,将所述的重组载体导入到出发菌中得到的重组菌株。
[0008]本专利技术还提供上述所述的重组菌株在提高大环内酯类抗生素的效价和得率中的应用。
[0009]有益效果:本专利技术提供了一种用于提高大环内酯类抗生素产量的重组载体,经过基因工程改造构建制备重组菌,在发酵生产中,减轻了终产物的反馈抑制作用,提高了米尔贝霉素,阿维菌素以及尼莫克丁的产量。
附图说明
[0010]图1为外排模块TuPPE对冰城链霉菌野生型中米尔贝霉素效价的影响,其中a是外排模块的设计图,Promoter为启动子,RBS为核糖体识别位点,Effluxpump为外排基因;b是组成型启动子过表达外排基因对米尔贝霉素效价的影响,其中横坐标是出发菌株BC
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4及对应过表达外排基因的重组菌株BCMiltAB1,BCMiltAB2,BCMiltAB6;纵坐标是米尔贝霉素的总效价及胞外效价;c是应用外排模块微调MiltAB2对米尔贝霉素效价的影响,其中横坐标是利用所述外排模块过表达MiltAB2重组载体的启动子(Promoter)及核糖体识别位点(RBS);纵坐标是米尔贝霉素的总效价;d是应用外排模块微调MiltAB1对米尔贝霉素效价的影响,其中横坐标是利用所述外排模块过表达MiltAB1重组载体的启动子(Promoter)及核糖体识别位点(RBS);纵坐标是米尔贝霉素的总效价;e是应用外排模块微调MiltAB6对米尔贝霉素效价的影响,其中横坐标是利用所述外排模块过表达MiltAB6重组载体的启动子(Promoter)及核糖体识别位点(RBS);纵坐标是米尔贝霉素的总效价;
[0011]图2为外排模块对米尔贝霉素效价的最佳改善作用,其中a是TuPPE在冰城链霉菌野生型中对米尔贝霉素总效价和胞外效价的最佳改善作用,其中,横坐标是出发菌株BC
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4及对应过表达外排基因的重组菌株WTM11c,WTM22d,WTM61c,纵坐标是米尔贝霉素的总效价和胞外效价;b是TuPPE在工业化链霉菌BC04中对米尔贝霉素总效价和胞外效价的最佳改善作用,其中,横坐标是出发菌株BC04及对应过表达外排基因的重组菌株HTM11c,HTM22d,HTM61c,纵坐标是米尔贝霉素的总效价和胞外效价;c是TuPPE在冰城链霉菌野生型中对米尔贝霉素得率的最佳改善作用,其中,横坐标是出发菌株BC
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4及对应过表达外排基因的重组菌株WTM11c,WTM22d,WTM61c,纵坐标是米尔贝霉素的得率;d是TuPPE在工业化链霉菌BC04中对米尔贝霉素得率的最佳改善作用,其中,横坐标是出发菌株BC04及对应过表达外排基因的重组菌株HTM11c,HTM22d,HTM61c,纵坐标是米尔贝霉素的得率;
[0012]图3为不同16元大环内酯类抗生素聚酮骨架图,其中,标灰色的地方是三种大环内酯结构相同的骨架;
[0013]图4为外排模块TuPPE在提高其他大环内酯效价方面的普适性,其中,a是TuPPE在阿维链霉菌中对阿维菌素总效价和胞外效价的最佳改善作用,其中,横坐标是出发菌株SAV
及对应外排基因过表达重组菌株,纵坐标是阿维菌素的总效价及胞外效价;b是TuPPE在蓝灰链霉菌中对尼莫克丁总效价和胞外效价的最佳改善作用,其中,横坐标是出发菌株Nem及对应外排基因过表达重组菌株,纵坐标是尼莫克丁的总效价及胞外效价。
具体实施例
[0014]冰城链霉菌野生型BC
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4(Streptomyces bingchenggensis),该菌株记载在Wang et al.Appl Microbiol Biotechnol(2020)104:2935
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2946DOI 10.1007/s00253
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020
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10410
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8。
[0015]工业化冰城链霉菌BC04(Streptomyces bingchenggensis),该菌株记载在Zhang et al.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI 10.1186/s12934
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016
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0552
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1。
[0016]阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis),为阿维链霉菌NEAU1069,该菌株记载在Wang et al.Journal ofAntibiotics(2011)64:591
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594DOI 10.1038/ja.2011.48。
[0017]蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus),为蓝灰链霉菌NMWT1,该菌株记载在Li et al.China Life Sciences(2019)15:152DOI 10.1007/s11427
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018
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9442
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9。
[0018]pSET152T整合大肠杆菌
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链霉菌穿梭载体,pSET152为商品化质粒,pSET152T为带有一个终止子序列的pSET152质粒。
[0019]大肠杆菌JM109作为所有质粒构建的宿主。
[0020]ET12567(pUZ8002)用于链霉菌与大肠杆菌接合转移,商品化菌株。
[0021]实施例1.
[0022]一、大环内酯外排模块的构建
[0023]以冰城链霉菌BC
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4基因组为模板(在GenBank上的登录号为Genome ID:CP002047.1),扩增了所有相关启动子及外排基因,其中大环内酯外排模块的组成部分包括启动子,核糖体识别位点以及外排基因。所述启动子与核糖体识别位点的组合片段为PiRj,其中Pi为启动子P1(序列如SEQ ID NO:1所示),P2(序列如SEQ ID NO:2所示),P3(序列如SEQ ID NO:3所示),P4(序列如SEQ ID NO:4所示),P5(序列如SEQ ID NO:5所示),Rj为核糖体识别位点Rn(Rn为每个启动子各自原本的核糖体识别位点序列),Ra(5'
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GGAG
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3'),Rb(5'
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高大环内酯抗生素产量的重组载体,其特征在于,所述重组载体的出发载体为pSET152T,以冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)BC
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4基因组为模板扩增启动子和外排基因,将所述启动子与所述外排基因连接得到外排模块整合到出发载体中即得到重组载体,所述启动子位于外排基因的上游。2.根据权利要求1所述的重组载体,其特征在于,所述启动子包括序列为P1序列SEQ ID NO:1所示、P2序列SEQ ID NO:2所示、P3序列SEQ ID NO:3所示、P4序列SEQ ID NO:4所示、P5序列SEQ ID NO:5所示或由核糖体识别位点5'
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GGAG
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3'、5'
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GAAAG
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3'、5'
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GAGGA
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3'或5'
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GGGGAG
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3'替代P1序列的5'
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GAGAGA
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3'得到的序列、P2序列的5'
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GGGAGA
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3'得到的序列、P3序列的5'
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GAAG
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3'得到的序列、P4序列的5'
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AAGGGG
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3'得到的序列或P5序列的AGGAGG得到的序列;所述外排基因的序列为SEQ ID NO:8所示、SEQ ID NO:11所示或SEQ ID NO:14所示。3.根据权利要求1所述的重组载体,其特...
【专利技术属性】
技术研发人员:向文胜,李珊珊,褚丽阳,张艳艳,董倬旭,
申请(专利权)人:中国农业科学院植物保护研究所,
类型:发明
国别省市:
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