一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用技术

本发明专利技术公开了一种纳他霉素高产菌株的构建方法，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中过表达负责GDP

Construction method, strain and application of a high natamycin producing strain

【技术实现步骤摘要】
一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用。

技术介绍

[0002]纳他霉素(Natamycin)，又称为匹马菌素，是目前市场上唯一的一个GRAS(Generallyregardedassafe)状态的抗真菌剂，在食品防腐、医疗、农业能领域广泛使用。当前纳他霉素的应用场景和需求的不断扩大，对高性能菌种和低成本生产提出了更高的需求。
[0003]现有纳他霉素生产菌株主要从野生型生产菌株经过传统诱变育种技术获得，传统的诱变技术的连续使用容易遇到瓶颈，不能获得菌株性能的持续提升。现代基因工程育种技术降低了传统诱变技术的盲目性和随机性，与诱变技术相结合能够获得菌株性能的进一步提升。
[0004]对纳他霉素基因簇相关基因进行遗传改造是获得纳他霉素高产菌株最直接的方式。在多种链霉菌，如纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)，恰塔努加链霉菌(Streptomyceschatanoogensm)，褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)，利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)中都有发现纳他霉素的产生。纳他霉素生物合成基因簇也已从多个产生菌中克隆鉴定。这些基因簇在基因组成和结构上非常相似。通过在StreptomyceslydicusA02中克隆并过表达基因簇包含的途径特异性调控基因slnM2，工程菌株的纳他霉素产量是出发菌株的3.0倍(JIndMicrobiolBiotechnol.2014Jan；41(1):163
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72.)。通过在褐黄孢链霉菌中过表达基因簇内部的信号蛋白编码基因(pimE)，工程菌的纳他霉素产量提高了72％(JMicrobiolBiotechnol.2016Feb；26(2):241
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7.)。通过前体合成途径的改造以加强前体供给是构建高产菌株的另一种有效基因工程育种方式。纳他霉素属于大环内酯聚酮类化合物，结构上由两部分组成：23元聚酮内酯环和海藻糖胺糖基，结构具体如下所示：
[0005][0006]聚酮内酯环的合成是以酰基辅酶A为前体，由基因簇编码的I型聚酮合酶催化下连
续组装而成。通过代谢工程的方法，过表达乙酰乳酸合成酶调控亚基(ilvH)，加强分支链氨基酸代谢途径，进而提高前体物质乙酰辅酶A的胞内供给，工程菌株纳他霉素产量提高了 32％(Appl Microbiol Biotechnol.2020May；104(10):4471
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4482.)。纳他霉素的另一个重要结构组分—海藻糖胺对纳他霉素的活性是必需的。合成海藻糖胺的直接前体是GDP
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甘露糖。但是，目前野生型菌株中GDP
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甘露糖的胞内供给是否是纳他霉素合成的瓶颈因素，目前还没有研究报道。
[0007]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种纳他霉素高产菌株的构建方法、菌株和应用。
[0009]本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：
[0010]一种纳他霉素高产菌株的构建方法，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中过表达负责 GDP
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甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶的编码基因的方式实现。
[0011]进一步地，所述负责GDP
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甘露糖合成的酶还包括磷酸甘露糖变位酶和GDP
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甘露糖焦磷酸化酶，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中同时过表达负责GDP
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甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶和GDP
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甘露糖焦磷酸化酶的编码基因的方式实现。
[0012]进一步地，所述负责GDP
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甘露糖合成的酶为纳他霉素生产菌自身来源的酶，或者为非自身来源的酶。
[0013]进一步地，所述纳他霉素生产菌为褐黄孢链霉菌，所述负责GDP
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甘露糖合成的酶为天蓝色链霉菌来源的酶。
[0014]进一步地，具体步骤如下：
[0015](1)构建重组质粒pOEmanABC：构建包含磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、 GDP
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甘露糖焦磷酸化酶编码基因的重组质粒，即从天蓝色链霉菌中分别扩增获得磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP
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甘露糖焦磷酸化酶的编码基因manA、manB、manC；三个基因放置在一个组成型启动子
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kasO*p控制组成一个转录单元，并克隆到整合型载体上，构建成重组质粒pOEmanABC；
[0016](2)将重组质粒pOEmanABC转化入纳他霉素生产菌，构建成manA、manB、manC 过表达菌株OEmanABC，工程菌OEmanABC即纳他霉素高产菌株，该菌株发酵生产纳他霉素的产量显著高于原始菌株。
[0017]利用如上所述的方法构建的纳他霉素高产菌株。
[0018]进一步地，所述纳他霉素高产菌株能够以葡萄糖作为发酵的碳源。
[0019]利用如上所述的菌株发酵生产纳他霉素的方法，包括如下步骤：
[0020]所述方法以葡萄糖作为发酵的碳源，且在采用发酵罐进行发酵过程中，通过流加的方式补充碳源，使得培养基中葡萄糖的浓度维持在1％以上。
[0021]进一步地，具体步骤如下：
[0022]将纳他霉素高产菌株的孢子悬液按2％
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4％的接种量接种到装有50ml种子培养基的 250ml的三角瓶中，28℃、200rpm培养两天，得种子培养液；然后将种子培养液按5％的接种量转接到发酵罐中，发酵罐中的发酵培养基的总体积占发酵罐总体积的60％，发酵罐温
度控制在28℃，600rpm，通气量为2v/v/m，发酵罐溶氧控制在30％以上；当发酵罐中葡萄糖的质量浓度低于1％时，在72h和96h各补加质量浓度为10％的葡萄糖溶液；或者，在反应过程中根据生产情况添加消泡剂控制泡沫，发酵5天，即得；
[0023]其中，每1L种子培养基的配方为：葡萄糖:20.0g；蛋白胨:6.0g；酵母浸出物:6.0g； Nacl:10.0g，pH 7.0，去离子水溶解后定容至1.0L，即得；
[0024]每1L发酵培养基的配方为：葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母浸出物5.0g，牛肉浸粉5.0g，去离子水溶解后定容至1.0L，即得。
[0025]利用如上所述的菌株在发酵生产纳他霉素方面中的应用。
[0026]本专利技术取得的有益效果是：
[0027]1、本专利技术方法通过在原始菌株中引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因或者同时引入受强启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶基因、磷酸甘露糖变位酶编码基因、GDP
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甘露糖焦磷酸化酶编码基因，实现工程菌株的构建。工程菌株在葡萄糖为碳源的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述方法是通过在纳他霉素生产菌中过表达负责GDP
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甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶的编码基因的方式实现。2.根据权利要求1所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述负责GDP
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甘露糖合成的酶还包括磷酸甘露糖变位酶和GDP
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甘露糖焦磷酸化酶，所述方法是通过在纳他霉素生产菌中同时过表达负责GDP
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甘露糖合成的酶即磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶和GDP
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甘露糖焦磷酸化酶的编码基因的方式实现。3.根据权利要求1所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述负责GDP
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甘露糖合成的酶为纳他霉素生产菌自身来源的酶，或者为非自身来源的酶。4.根据权利要求1所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：所述纳他霉素生产菌为褐黄孢链霉菌，所述负责GDP
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甘露糖合成的酶为天蓝色链霉菌来源的酶。5.根据权利要求1至4任一项所述的纳他霉素高产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)构建重组质粒pOEmanABC：构建包含磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP
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甘露糖焦磷酸化酶编码基因的重组质粒，即从天蓝色链霉菌中分别扩增获得磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP
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甘露糖焦磷酸化酶的编码基因manA、manB、manC；三个基因放置在一个组成型启动子
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kasO*p控制组成一个转录单元，并克隆到整合型载体上，构建成重组质粒pOEmanABC；(2)将重组质粒pOEm...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩，谢周杰，李浩，王冠一，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：