一种林麝香囊腺细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，且公开了一种林麝香囊腺细胞培养方法，包括以下工作步骤：第一步：取材；第二步：消化；第三步：单细胞制备分离；第四步：原代培养；第五步：传代培养。第六步：冷冻保存和复苏；第七步：细胞增殖检测；第八步：镜检；第九步：代谢物检测。本发明专利技术中，取出泌香盛期林麝香囊腺组织，置入含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗、去除外膜和结缔组织；用无菌眼科剪将组织剪碎后加入Ⅳ型胶原酶于37℃消化5h后再加0.25mg/mL胰蛋白酶消化约15分钟。用DMEM培养基终止消化，消化液过滤后于600r/min离心3min，弃上清，将获得的细胞悬液加入完全培养基中再次离心，重复3次，收集分散的细胞。的细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种林麝香囊腺细胞培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种林麝香囊腺细胞培养方法。

技术介绍

[0002]林麝，为麝科麝属动物，在中国主要分布于宁夏六盘山、陕西秦岭山脉，东至安徽、湖南，西至四川、西藏、云南，南至贵州、广东及广西，其以树叶、杂草、苔藓、嫩芽、地衣及各种野果为食。成年林麝体重6～9kg，体长630～800mm，雌、雄麝都不长角，雄麝的上犬齿发达，长而尖，露出口外，呈獠牙状。尾巴很短，四肢细长，蹄子比较狭而尖，耳朵长而直立；毛粗硬、曲折呈波浪状，呈深棕色，成体不具斑点。
[0003]麝香长在麝鹿成熟雄体的肚脐和生殖器之间的香囊腺体中，香囊腺由麝香分泌腺与麝香囊两部分组成。麝香分泌腺属复管泡腺,是分泌麝香液，产生麝香的组织。麝香囊是浓缩麝香液，贮存麝香的处所，覆盖麝香腺的皮肤，有汗腺及皮脂腺，二者开口于皮肤外表，麝香囊颈部只有皮脂腺。麝香分泌腺的排泄管，开口于麝香囊颈部皮脂腺间，毛干上端，或直接开口于颈部表皮，进入麝香囊。
[0004]传统名贵中药材麝香是成年雄麝香囊中的干燥分泌物，由于其重要基原动物林麝的数量稀少，且单产极低，造成麝香资源供不应求。国家严格限定天然麝香仅用于安宫牛黄丸、六神丸、八宝丹、片仔癀、醒脑静注射液、麝珠明目滴眼液、西黄丸的制备，但目前麝香的产量仅能满足市场需求的0.5～2％。
[0005]细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，而且细胞培养本身就是细胞的克隆，细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术。通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢等分子机制。为采用细胞工程学方法大量生产麝香做理论铺垫，也对国家一级保护动物林麝的资源保护和综合利用有积极的促进作用。
[0006]为此，我们提出一种林麝香囊腺细胞培养方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供一种林麝香囊腺细胞培养方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案，一种林麝香腺上皮细胞培养方法，包括以下工作步骤：
[0009]第一步：取材；
[0010]第二步：消化；
[0011]第三步：细胞制备；
[0012]第四步：原代培养；
[0013]第五步：传代培养；
[0014]第六步：冷冻保存和复苏；
[0015]第七步：细胞增殖检测；
[0016]第八步：镜检；
[0017]第九步：代谢物检测。
[0018]作为优选，所述第一步，切取林麝香囊腺组织，剪下一小块置入含有青霉素
‑
链霉素的PBS中清洗、去除外膜和结缔组织。
[0019]作为优选，所述第二步，将第一步切取的材料剪碎后加入Ⅳ型胶原酶后于37℃消化5h后再加0.25mg/mL胰蛋白酶消化约15分钟。
[0020]作为优选，所述第三步，将第二步中的材料加入DMEM培养基终止消化，消化液过滤后于600r/min离心3min，弃上清，将获得的细胞悬液加入完全培养基中再次离心，重复3次，收集分散的细胞。
[0021]作为优选，所述第四步，将制备好的单细胞溶液稀释至1
×
104‑5×
104个/mL后接种入培养瓶中温箱培养，细胞贴壁后更新完全培养基，之后每24小时更换一次培养基。
[0022]作为优选，所述第五步，检测并确定培养的细胞没有被污染物，当单层细胞贴壁长满后用0.25mg/mL胰蛋白酶消化后进行传代培养。
[0023]作为优选，所述第六步，将传代培养第二代的细胞进行冷冻保存，具体操作：用0.25mg/mL胰蛋白酶消化，离心收集后在4℃下加入1.5mL冷沉淀物(含有10％DMSO的完全培养基)，冷冻3min后
‑
20℃冷冻1h，最终冻保存于液氮罐。复苏操作：冷冻管从液氮中取出迅速在37℃水浴中熔融，加入5mL新鲜培养基，1000r/min离心5min，弃上清，加入完全培养基，细胞悬浮液匀浆后进行培养，之后每隔24h更换一次培养基。
[0024]作为优选，所述第七步，用CCK8试剂盒检测细胞活性和增殖情况。
[0025]作为优选，所述第八步，第一观察段：培养液清澈，没有细菌污染，细胞贴壁较少，发现两种细胞型，换液；第二观察段：传代，待细胞生长连接成片后，用BSS洗1～2次，加1：1的0.025％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合消化3～5分钟，待细胞回缩，便停止消化，弃掉消化液，用BSS洗1～2次，注入营养液，吹打，制成细胞悬液，再接种培养即为传代培养。传代后分别为培养瓶A1和培养瓶A2，剩下的冻存三管。第三观察段：发现可能疑似成纤维维细胞；第四观察段：将培养瓶A1和培养瓶A2消化之后，冻存三管，标号1，其余的传代到原有瓶中。
[0026]作为优选，所述第八步，第五观察段：所有培养瓶都长有脂滴，细胞板组织里没有。第六观察段：第五观察段中多数分泌脂滴的细胞，少数有圆形成团的不分泌脂滴的细胞，培养瓶A1和培养瓶A2中只有一种细胞，可能是成纤维细胞。第七观察段：在培养瓶A1和培养瓶A2里都有少量的脂滴，细胞长势不够好，有停止分化的趋势，复苏一管2；另外传代的三瓶细胞里都有脂滴，在视野大致能看到成纤维和香囊腺细胞两种形态。第八观察段：换液，培养瓶A1和培养瓶A2里消化下来，最先消化的多是多角形的细胞，其中培养瓶A1瓶子有一大片类似上皮细胞的形态，消化了三次难以消化，培养瓶A1和培养瓶A2里的细胞冻存三管，外部标1。第九观察段：将第七观察段中传代的细胞脂滴明显逐渐增多的细胞进行消化两次，洗三次，送检。
[0027]作为优选，所述第八步，第十观察段：将细胞板里的细胞用油红染色，发现用成脂诱导分化的细胞里没有脂滴，其余四个孔没有加诱导剂的却有脂滴，其中有一个孔的脂滴很多。
[0028]作为优选，所述第九步，将第七观察段中的细胞用胰蛋白酶消化，收集贴壁细胞，4
℃，1200rpm离心5min去上清，加1mL PBS，4℃，900rpm离心3min去上清，于液氮淬灭4min，用GC
‑
MS法检测并比较离体细胞代谢物与在体获得麝香成分的差异。
[0029]有益效果
[0030]本专利技术提供了一种林麝香囊腺细胞培养方法。具备以下有益效果：
[0031](1)该一种林麝香囊腺细胞培养方法，剪开泌香盛期雄性林麝香囊的毛囊皮质层，剪下一小块香腺组织置入含有青霉素
‑
链霉素PBS中清洗、去除外膜和结缔组织。用无菌眼科剪将组织剪碎后加入Ⅳ型胶原酶后于37℃消化5h后再加0.25mg/mL胰蛋白酶消化约15分钟。然后加入DMEM培养基终止消化，消化液过滤后于600r/min离心3min，弃上清，将获得的细胞悬液加入完全培养基中再次离心，重复3次，收集分散的细胞。通过Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶双重消化，达到了快速制得细胞悬液的效果。
[0032](2)该本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种林麝香囊腺细胞培养方法，其特征在于：包括以下工作步骤：第一步：取材；第二步：消化；第三步：细胞制备；第四步：原代培养；第五步：传代培养；第六步：冷冻保存和复苏；第七步：细胞增殖检测；第八步：镜检；第九步：代谢物检测。2.根据权利要求1所述的一种林麝香囊腺细胞培养方法，其特征在于：所述第一步，剪开泌香盛期成年雄性林麝香囊的毛囊皮质层，剪下一小块香腺组织置入含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗、去除外膜和结缔组织。3.根据权利要求1所述的一种林麝香囊腺细胞培养方法，其特征在于：所述第二步，将第一步切取的材料用无菌眼科剪将组织剪碎后加入Ⅳ型胶原酶后于37℃消化5h后再加0.25mg/mL胰蛋白酶消化约15分钟。4.根据权利要求2所述的一种林麝香囊腺细胞培养方法，其特征在于：所述第三步，将第二步中的材料加入DMEM培养基(10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100IU/mL青霉素
‑
链霉素)终止消化，消化液过滤后于600r/min离心3min，弃上清，将获得的细胞悬液加入完全培养基中再次离心，重复3次，收集分散的细胞。5.根据权利要求1所述的一种林麝香囊腺细胞培养方法，其特征在于：所述第四步，将制备好的单细胞溶液稀释至1
×
104‑5×
104个/mL后接种入培养瓶中温箱培养，细胞贴壁后更新完全培养基(Ham's F12培养基、20％胎牛血清(FBS)、1％青霉素
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链霉素、10ng/mL表皮生长因子(EGF)、2mM谷氨酰胺、0.1mMβ
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巯基乙醇)，之后每24小时更换一次培养基。6.根据权利要求1所述的一种林麝香囊腺细胞培养方法，其特征在于：所述第五步，检测并确定培养的细胞没有被细菌、酵母、真菌和支原体等污染物，当单层细胞贴壁长满后用0.25mg/mL胰蛋白酶消化后进行传代培养。7.根据权利要求1所述的一种林麝香囊腺细胞培养方法，其特征在于：所述第六步，将细胞传代培养至第二代的细胞用0.25mg/mL胰蛋白酶消化，离心收集后在4℃下加入1.5mL冷沉淀物(含有10％DMSO的完全培养基)，冷冻3min后
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20℃冷冻1h，最终冻保存于液氮罐。冷冻管从液氮中取出迅速在37℃水浴中熔融，加入5ml新鲜培养基，1000r/min离心5min，弃上清，加入完全...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐忠鲜，李锋，竭航，李地艳，张泽均，胡杰，张炼，
申请(专利权)人：西华师范大学，
类型：发明
国别省市：