一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法技术

本发明专利技术提供一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，包括步骤：(1)麻醉和抗凝；(2)插管；(3)原位灌注；(4)体外消化并获取总细胞悬液；(5)KC和HSC的纯化、分离；(6)细胞培养及形态观察；(7)存活率检测；(8)细胞鉴定。本发明专利技术使用健康成年SD雄鼠，200～350g，通过原位灌注、消化和体外消化、梯度离心和差速贴壁分离法，达到了存活率可达到95％以上、纯度可达到90％以上等效果。纯度可达到90％以上等效果。

【技术实现步骤摘要】
一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法。

技术介绍

[0002]肝脏疾病已成为世界不可忽视的健康问题之一。肝脏是人体器官中的最大的消化腺及代谢中心，其在多种功能中发挥重要作用。肝脏作为一个异质性的器官，其由不同细胞类型构成—肝实质细胞如肝细胞和非实质细胞如库普弗细胞(Kupffer cell，KC)、肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)、肝窦内皮细胞等，其中，KC和HSC分别约占肝脏细胞总数的15％～20％、5％
‑
8％
[1]。
[0003]HSC也称为肝贮脂细胞和维生素A贮存细胞，是肝脏稳态的主要调节因子，也是肝纤维化时的关键效应者
[2]。HSC作为细胞外基质(ECM)合成的主要细胞群，其除能分泌糖蛋白和蛋白多糖等ECM成分，还能合成一定的胶原酶来维持正常的基底膜结构。然而，当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，将会导致HSC的活化、增殖及转化。KC是位于肝脏血窦腔面或游离于窦周间隙的常驻巨噬细胞，是单核巨噬细胞系统的重要成员
[3]。稳态情况下，KC是肝脏防御系统的第一道防线，它具有强吞噬能力和分泌细胞因子、趋化因子的功能，是维持肝脏稳态、损伤和感染后恢复肝功能的关键细胞
[4]。当肝脏受到各种外界因素刺激时，可引起KC大量增殖并释放多种炎性介质如白介素
‑
1β(IL
‑
>1β)、肿瘤坏死因子
‑
α(TNF
‑
α)、白介素
‑
6(IL
‑
6)等加重肝损伤
[5]。近来研究表明，KC在肝炎、肝纤维化、肝癌等肝脏疾病进展中发挥重要作用
[6]。
[0004]众所周知，炎症反应是肝纤维化发生过程中不可或缺的环节，而HSC的活化主要是由于KC的炎症反应所引起
[7]。当肝细胞受到各种外界因素刺激时，可引起KC大量增殖并释放多种炎性介质，如IL
‑
1β、TNF
‑
α、IL
‑
6等，通过促进HSC的活化和分化，在肝纤维化过程中发挥重要作用
[8]。因此，对于HSC和KC在肝纤维化中的作用研究已成为探究肝纤维化治疗的重要一环。然而，如何从大鼠体内同时获取高得率的HSC和KC依旧是目前的一个难题。因此，为了更好地了解KC与HSC在肝纤维化损伤中的发挥何种作用，需要一种可以快速、经济和可复制的方式从单只大鼠肝脏中获得功能完整、足够数量、纯度和活力的KC和HSC，进而本专利技术团队研发出一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有技术难题如何从大鼠体内同时获取高得率的KC和HSC，提供一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法。
[0006]为了解决上述所涉及到的问题，本专利技术采取如下方法获得KC和HSC：
[0007]一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，包括如下步骤：
[0008](1)麻醉和抗凝：取健康成年SD大鼠1只，200
‑
350g，禁食12小时后，按0.8
‑
1.0％戊
巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.2
‑
0.4％抗凝剂、0.2ml/100g体质量，麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部，再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉；
[0009](2)插管：取24GY型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1
‑
2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流；
[0010](3)原位灌注：灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，灌注灌注液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速为50
‑
70r/min，时间为20
‑
30min，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈；灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(肝脏出现裂纹)，换灌注液灌注，流速为30
‑
50r/min，时间为10
‑
20min，消化至肝脏失去弹性，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞；
[0011](4)体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入20
‑
40ml消化分散液，封口膜封口，35
‑
40℃、90
‑
110r/min，振荡消化20
‑
40min，直至消化液呈匀浆状，加入20
‑
40ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后40
‑
100um细胞筛过滤未消化组织块1
‑
3遍，50ml离心管收集滤液，即得肝脏细胞混悬液；
[0012](5)KC和HSC的纯化、分离：步骤(4)中所得细胞混悬液，100
‑
300rpm，3
‑
5℃离心4
‑
6min，上清重复2
‑
4次；取上清，500
‑
1000rpm，3
‑
5℃离心8
‑
12min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1300
‑
1500rpm，3
‑
5℃离心20
‑
30min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，800
‑
1200rpm，离心4
‑
6min，1
‑
3次，取沉淀，整个离心操作步骤均在冰上进行；
[0013](6)细胞培养及形态观察：步骤(5)中所得沉淀用预热的含20％胎牛血清的完全培养基重悬，进行细胞计数及台盼蓝拒染，调整细胞浓度为1
‑2×
106细胞/ml，接种2
‑
4ml细胞悬液至Ⅰ型鼠尾胶原过夜包被过的6cm培养皿，37℃、5％CO2培养，KC培养50
‑
70min后换液，HSC培养110
‑
130min换液，之后视情况换液；
[0014](7)存活率检测：采用0.4％台盼蓝拒染及吉姆萨染色检测KC存活率，0.4％台盼蓝拒染检测HSC存活率；
[0015](8)细胞鉴定：采用印度墨汁吞噬实验、CD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)麻醉和抗凝：取健康成年SD大鼠1只，200
‑
350g，禁食12小时后，按0.8
‑
1.0％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.2
‑
0.4％抗凝剂、0.2ml/100g体质量，麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部，再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉；(2)插管：取24G Y型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1
‑
2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流；(3)原位灌注：灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，灌注灌注液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速为50
‑
70r/min，时间为20
‑
30min，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈；灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(肝脏出现裂纹)，换灌注液灌注，流速为30
‑
50r/min，时间为10
‑
20min，消化至肝脏失去弹性，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞；(4)体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入20
‑
40ml消化分散液，封口膜封口，35
‑
40℃、90
‑
110r/min，振荡消化20
‑
40min，直至消化液呈匀浆状，加入20
‑
40ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后40
‑
100um细胞筛过滤未消化组织块1
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3遍，50ml离心管收集滤液，即得肝脏细胞混悬液；(5)KC和HSC的纯化、分离：步骤(4)中所得细胞混悬液，100
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300rpm，3
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5℃离心4
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6min，上清重复2
‑
4次；取上清，500
‑
1000rpm，3
‑
5℃离心8
‑
12min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1300
‑
1500rpm，3
‑
5℃离心20
‑
30min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，800
‑
1200rpm，离心4
‑
6min，1
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王大朋，宋倩，何瑞，刁珩，金英，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：