人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用技术

本发明专利技术提供人肠上皮化生气液界面模型构建用培养基、构建方法和应用，其中增殖培养基由Wnt3a、R

【技术实现步骤摘要】
人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质冻干
，具体涉及人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用。

技术介绍

[0002]胃癌(gastric cancer，GC)是全球癌症死亡的主要原因。我国胃癌的发病率位居第2位，仅次于肺癌。肠型胃腺癌是最常见的胃癌组织学类型，之前的研究表明肠型胃腺癌是通过明确的组织学状态发展起来的，从慢性胃炎开始，发展到肠上皮化生、不典型增生和癌症。肠上皮化生(intestinal metaplasia，IM)是指胃黏膜上皮被肠型腺上皮替代，出现吸收细胞、杯状细胞及潘氏细胞，有时还可见黏膜表面形成绒毛状结构。肠上皮化生是一种公认的癌前状态，目前是肠型胃腺癌发展中难以逆转的第一个关键步骤。关于肠化机制及可能治疗方法的研究工作受其模型进展的制约，目前尚无肠上皮化生细胞系及体外实验的公开报道。
[0003]自2010年，培养类器官的技术迅速发展，被“Science”评为2013年最大的科学进步之一，并被“Nature Methods”评为2017年生命科学领域年度技术。类器官利用干细胞在3D培养下形成“自组织”，能在体外模拟其来源组织器官的特定结构和功能，并具有自我更新和分化能力。目前国内外均已成功构建人胃上皮类器官，其优势包括：结构和功能仿真，能长期增殖(半永久、培养时间＞1年)，取材小，具有个体信息、适合个体化治疗等。然而类器官有一定的不足：如操作复杂(常需要类器官内微注射)，不具备黏液层，传代间隔短(一般7
‑
10天，无法长期药物处理)。近年来发展起来的气液界面(air
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liquid interface，ALI)培养模型则可弥补类器官的不足，能实现原代细胞培养中与类器官系统的互补，但ALI模型的成功建立存在一定难度，是目前业内比较热门也比较棘手的研究。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题和缺陷，本专利技术提供人肠上皮化生气液界面模型的培养基、构建方法和应用。本专利技术的技术方案为：
[0005]第一方面，本专利技术提供一种人肠上皮化生气液界面模型的增殖培养基，包括以下终浓度的组分：Wnt3a 30％
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50％；R
‑
spondin 1 15％
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25％；重组人表皮生长因子(human EGF)10
‑
50ng/ml；重组人成纤维细胞生长因子
‑
10(human FGF
‑
10)50
‑
500ng/ml；重组人Noggin蛋白(human noggin)50
‑
500ng/ml；人胃泌素(human gastrin)5
‑
50nM；B27 2％；N2 1％；Y
‑
27632 1.5
‑
7.5μM；A83
‑
01 0.5
‑
5μM；烟酰胺(Nicotinamide)5
‑
50mM；4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)10mM；Glutamax1％；Advanced DMEM/F
‑
12 18.45％
‑
48.45％。
[0006]第二方面，本专利技术提供一种人肠上皮化生气液界面模型的分化培养基，包括以下终浓度的组分：重组人表皮生长因子(human EGF)10
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50ng/ml；重组人成纤维细胞生长因子
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10(human FGF
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10)50
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500ng/ml；重组人Noggin蛋白(human noggin)50
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500ng/ml；人胃泌素(human gastrin)5
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50nM；B27 2％；N2 1％；Y
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27632 1.5
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7.5μM；A83
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01 0.5
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5μM；烟
酰胺(Nicotinamide)5
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50mM；4
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羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)10mM；Glutamax1％；Advanced DMEM/F
‑
12 93.45％。
[0007]第三方面，本专利技术提供一种人肠上皮化生气液界面模型构建方法，是将获得的待培养人肠上皮化生细胞采用具有上下小室的细胞培养小室，上小室加入待培养人肠上皮化生细胞，下小室加入上述增殖培养基，在气液界面条件下进行培养。
[0008]进一步地，所述待培养人肠上皮化生细胞的获取包括以下步骤：
[0009]1)用PBS溶液对人肠上皮化生组织进行多次冲洗，之后去除明显脂肪组织，并剪成1
±
0.1mm2组织小块；
[0010]2)在剪切好的组织小块中加入消化试剂，于37℃震荡消化30
±
10min，静置使组织沉淀，去除上清；
[0011]3)将消化后的组织中的细胞分离，再用含胎牛血清(FBS)的Advanced DMEM/F12培养基重悬细胞，将细胞悬液于4℃、250g离心5min后，弃上清液，收集细胞沉淀并计数。
[0012]进一步地，所述PBS溶液含1％青/链霉素、50μg/ml庆大霉素和1.25μl/ml两性霉素B。
[0013]进一步地，所述消化试剂为螯合剂或胶原酶。
[0014]进一步地，所述具有上下小室的细胞培养小室在使用前进行以下预处理：将细胞培养小室置于24孔细胞培养板，以10μg/cm2的浓度将胶原蛋白(Collagen)稀释后加至上小室，于37℃放置30
‑
60min，吸去Collagen稀释液并用PBS洗2次。
[0015]进一步地，所述上小室加入待培养人肠上皮化生细胞，下小室加入上述培养基，在气液界面条件下进行培养，具体包括：
[0016]将待培养人肠上皮化生细胞以1000
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1250个/μl重悬于200μl增殖培养基中并加至上小室，下小室中加入增殖培养基，于37℃、5％CO2培养3天后去除上小室中的增殖培养基，开始气液界面培养，期间每3天去除上小室内粘液并更换下小室中的增殖培养基，培养10～14天得到该模型。
[0017]第四方面，本专利技术提供一种人肠上皮化生气液界面模型的增殖培养方法，采用具有上下小室的细胞培养小室，包括以下步骤：
[0018](1)将获得的人肠上皮化生气液界面模型采用胰酶于37℃消化30min；
[0019](2)将细胞收集至含FBS的Advanced DMEM/F12培养基终止消化，并计数；
[0020](3)将细胞培养小室置于24孔细胞培养板，以10μg/cm2的浓度将胶原蛋白(Collagen)稀释后加至上小室，于37℃放置30
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60min，吸去Collagen稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人肠上皮化生气液界面模型的增殖培养基，其特征在于：包括以下终浓度的组分：Wnt3a 30％
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50％；R
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spondin 1 15％
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25％；human EGF10
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50ng/ml；human FGF
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1050
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500ng/ml；human noggin50
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500ng/ml；human gastrin5
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50nM；B27 2％；N2 1％；Y
‑
27632 1.5
‑
7.5μM；A83
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01 0.5
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5μM；Nicotinamide5
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50mM；HEPES10mM；Glutamax1％；Advanced DMEM/F
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12 18.45％
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48.45％。2.一种人肠上皮化生气液界面模型的分化培养基，其特征在于：包括以下终浓度的组分：human EGF10
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50ng/ml；human FGF
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1050
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500ng/ml；human noggin50
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500ng/ml；human gastrin5
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50nM；B27 2％；N2 1％；Y
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27632 1.5
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7.5μM；A83
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01 0.5
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5μM；Nicotinamide5
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50mM；HEPES10mM；Glutamax1％；Advanced DMEM/F
‑
12 93.45％。3.一种人肠上皮化生气液界面模型构建方法，其特征在于：是将获得的待培养人肠上皮化生细胞采用具有上下小室的细胞培养小室，上小室加入待培养人肠上皮化生细胞，下小室加入权利要求1所述的增殖培养基，在气液界面条件下进行培养。4.根据权利要求3所述的一种人肠上皮化生气液界面模型构建方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘思濛，温慧娟，孙向东，李富豪，
申请(专利权)人：郑州大学第五附属医院，
类型：发明
国别省市：