一种乳源外泌体及提取方法技术

本发明专利技术涉及一种乳源外泌体的提取方法，依次按下述步骤进行：(1)将乳原料分装，离心，取清液；(2)将步骤(1)得到的清液离心，取中间层清液；(3)将步骤(2)得到的中间层清液离心，取清液，与PBS缓冲液和外泌体提取试剂混匀，孵育；(4)将步骤(3)的产物离心，保留沉淀，用PBS缓冲液重悬；(5)将步骤(4)的产物离心，取上清，即得。采用本发明专利技术提供的乳源外泌体提取方法制备的乳源外泌体，相较于其他方法制备的乳源外泌体而言，形态更完整，需要的样品体积更少，且在分离后包含的乳源外泌体的蛋白种类更多，更有利于分析研究作业。有利于分析研究作业。

【技术实现步骤摘要】
一种乳源外泌体及提取方法


[0001]本专利技术涉及乳制品
，特别是乳源外泌体及提取方法。

技术介绍

[0002]外泌体是细胞主动分泌产生的双层膜结构圆形或椭圆形囊泡，直径在30
‑
200nm，密度为1.13
‑
1.19g/mL。1983年，首次在网织红细胞中转铁蛋白受体的研究中发现50nm的小囊泡。1987年，加拿大学者Rose Johnstone创造“Exosome”一词并认为外泌体只是细胞向外界环境“排泄”的工具。2007年，Valadi等提出外泌体包含mRNA和miRNA并可以将其传递给另一个细胞，至此外泌体的功能及其机制开始得到广泛研究。外泌体存在于各种体液环境中，如血清、尿液、唾液、乳汁、羊水等。生物体液中的外泌体表明其起源细胞的功能状态，在医学上可作为肝癌、前列腺癌等疾病的生物诊断标记物；由于外泌体的膜结构还可以作为药物载体表现出高效药物传递的特性，例如外泌体负载不稳定的姜黄素可提高治疗效果。
[0003]乳源外泌体是由乳腺上皮细胞分泌的小囊泡，其主要组成成分是蛋白质、脂质以及核酸。乳源外泌体膜表面具有特异性膜蛋白，如最丰富的四跨膜蛋白(CD9、CD82、CD81和CD63)，以及共刺激分子(CD54)和粘附分子(CD11b)。脂类(磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和磷脂酰肌醇)也常见于外泌体中。乳源外泌体中核酸主要包括非编码单链RNA分子(micro RNA，mi RNA)、长链非编码RNA(long non
‑
coding RNA，lnc RNA)、环状RNA(circular RNA，circ RNA)、m RNA和t RNA等。乳源外泌体在生理过程中发挥着重要功能，如介导细胞交流、促进细胞生长以及参与免疫反应等。
[0004]目前常用的外泌体分离技术是离心法，但是离心法会对外泌体的形态造成损伤。
[0005]因鉴于此，特提出此专利技术。

技术实现思路

[0006]为了解决现有的技术问题，本专利技术提供了一种新的乳源外泌体的提取方法，该提取方法对外泌体的形态影响较小。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种乳源外泌体的提取方法，依次按下述步骤进行：
[0009](1)将乳原料分装，离心，取清液；
[0010](2)将步骤(1)得到的清液离心，取中间层清液；
[0011](3)将步骤(2)得到的中间层清液离心，取清液，与PBS缓冲液和外泌体提取试剂混匀，孵育；
[0012](4)将步骤(3)的产物离心，保留沉淀，用PBS缓冲液重悬；
[0013](5)将步骤(4)的产物离心，取
[0014]优选或可选地，步骤(1)中的离心工艺为室温下1500
‑
2500
×
g离心5
‑
15min。
[0015]优选或可选地，步骤(2)中的离心工艺为室温下8500
‑
10000
×
g离心25
‑
35min，优选的，离心时间为30min。
[0016]优选或可选地，步骤(3)中的离心工艺为室温下8500
‑
10000
×
g离心25
‑
35min，优选的，离心时间为30min。
[0017]优选或可选地，步骤(3)中，清液、PBS缓冲液和外泌体提取试剂的体积比为1:1:1。
[0018]优选或可选地，所述外泌体提取试剂为Thermo Fisher公司生产的总外泌体分离试剂。
[0019]优选或可选地，步骤(3)中，孵育时间为25
‑
35min，优选的，孵育时间为30min。
[0020]优选或可选地，步骤(4)中离心工艺为室温下8500
‑
10000
×
g离心9
‑
11min，优选的，离心时间为10min。
[0021]优选或可选地，步骤(5)中离心工艺为室温下8500
‑
10000
×
g离心4
‑
6min，优选的，离心时间为5min。
[0022]第二方面，本专利技术还提供了一种乳源外泌体，采用上述的提取方法制备而成。
[0023]有益效果
[0024]采用本专利技术提供的乳源外泌体提取方法制备的乳源外泌体，相较于其他方法制备的乳源外泌体而言，形态更完整，需要的样品体积更少，且在分离后包含的乳源外泌体的蛋白种类更多，更有利于分析研究作业。
附图说明
[0025]图1为实施例1制备的乳源外泌体的投射电子显微镜图像；
[0026]图2为实施例2制备的乳源外泌体的投射电子显微镜图像；
[0027]图3为对比例1制备的乳源外泌体的投射电子显微镜图像；
[0028]图4为对比例2制备的乳源外泌体的投射电子显微镜图像；
[0029]图5为对比例3制备的乳源外泌体的投射电子显微镜图像；
[0030]图6为对比例4制备的乳源外泌体的投射电子显微镜图像；
[0031]图7为实施例1和对比例1和3制备的乳源外泌体分离外泌体蛋白种类韦恩图。
具体实施方式
[0032]为了便于理解本专利技术，下面将结合说明书附图和较佳实验例对本专利技术作更全面、细致地描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体的实施例。
[0033]除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本专利技术的保护范围。
[0034]除非另有特别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0035]实施例1
[0036]本实施例提供了一种乳源外泌体的提取方法。
[0037]所述乳源外泌体的乳原料来自于北京三元食品有限公司的鲜奶灌装车。
[0038]将乳原料分装在1mL离心管中，每管中均添加1mL样品，在室温，2000
×
g下离心10min，离心完成后取清液，在室温，10000
×
g下再次离心30min，取中间层清液。
[0039]将中间层清液在室温，10000
×
g下离心30min后，取200μL清液，并与200μL PBS缓
冲液混匀，再添加200μL Thermo Fisher公司生产的总外泌体分离试剂，混匀，在室温下孵育反应30min后，在室温下，10000
×
g离心10min，取沉淀。
[0040]将沉淀用50μL PBS缓冲液重悬，在室温下，10000
×
g离心5min，取上清即为提取出的外泌体。
[0041]实施例2
[0042]本实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳源外泌体的提取方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：(1)将乳原料分装，离心，取清液；(2)将步骤(1)得到的清液离心，取中间层清液；(3)将步骤(2)得到的中间层清液离心，取清液，与PBS缓冲液和外泌体提取试剂混匀，孵育；(4)将步骤(3)的产物离心，保留沉淀，用PBS缓冲液重悬；(5)将步骤(4)的产物离心，取上清，即得。2.根据权利要求1所述的乳源外泌体的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的离心工艺为室温下1500
‑
2500
×
g离心5
‑
15min。3.根据权利要求1所述的乳源外泌体的提取方法，其特征在于，步骤(2)中的离心工艺为室温下8500
‑
10000
×
g离心25
‑
35min，优选的，离心时间为30min。4.根据权利要求1所述的乳源外泌体的提取方法，其特征在于，步骤(3)中的离心工艺为室温下8500
‑
10000
×
g离心25
‑
35min，优选的，离心时间为...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈历俊，李莹，陈璟瑶，乔为仓，张明辉，赵军英，杨宝雨，
申请(专利权)人：北京三元食品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：