一种肿瘤抗原/MHC-I复合物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种肿瘤抗原/MHC

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤抗原/MHC
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I复合物及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及免疫学领域，尤其涉及一种肿瘤抗原/MHC
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I复合物及其制备方法和在体外富集CD8
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T细胞、刺激相同来源肿瘤浸润淋巴细胞的活化、增殖和/或制备治疗肿瘤的药物中的用途；还涉及一种体外富集CD8
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T细胞的方法及所得的CD8
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T细胞、一种体外刺激相同来源肿瘤浸润淋巴细胞的活化、增殖的方法及所得的肿瘤浸润淋巴细胞、相应的药物组合物，以及肿瘤的治疗方法。

技术介绍

[0002]免疫系统与肿瘤之间的关系错综复杂：一方面，免疫系统能够通过多种免疫效应机制杀伤或清除肿瘤细胞；另一方面，肿瘤细胞也能通过多种机制抵抗或逃避免疫系统对其的杀伤和清除。肿瘤初期，免疫系统尝试清除被认为是“外源性”的肿瘤细胞，然而肿瘤细胞通过抗原缺失、减少自身抗原提呈、抗原调变、共刺激信号缺乏以及分泌免疫抑制性物质等方式，建立免疫抑制状态，逃脱机体免疫识别。因此，如何通过肿瘤细胞表达的肿瘤抗原诱导T淋巴细胞的抗肿瘤免疫应答是肿瘤免疫治疗研究的关键。
[0003]所谓肿瘤抗原是指细胞癌变过程中出现的新抗原(neoantigen)或肿瘤细胞异常表达或过表达的抗原物质。T细胞能够区分肿瘤细胞和正常细胞，是通过特异性的识别肿瘤细胞表达的独特的肿瘤抗原而引发免疫反应。尽管肿瘤细胞表达肿瘤抗原，但大多数肿瘤细胞的免疫原性比较弱，难以诱导机体产生针对这些抗原的特异性免疫应答。与此同时，肿瘤细胞通过下调或关闭主要组织相容性复合体(MHC)的表达，或者直接下调肿瘤抗原的产生，使MHC递呈肿瘤抗原的能力下降，导致体内针对肿瘤抗原应有的免疫应答缺乏特异性或能力不足以清除肿瘤细胞，造成肿瘤患者产生的免疫应答常不能有效清除肿瘤细胞。
[0004]肿瘤过继细胞治疗(adoptive Cell therapy,ACT)是将经体外扩增和激活处理的自体或异体免疫细胞(主要是自体细胞)过继回输入肿瘤患者体内，以增强患者免疫功能，达到治疗目的的方法。在过继性T细胞治疗过程中，T淋巴细胞是杀伤肿瘤细胞的最终执行者，其中，细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)是抗肿瘤免疫的主要效应细胞，介导特异性抗肿瘤免疫反应。在体内，这一作用过程依赖细胞间接触，在抗原呈递的过程中，肿瘤抗原可以递呈在MHC I类分子上，供T细胞识别，诱导CD8
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细胞毒性T细胞的激活，启动适应性免疫应答。
[0005]人的MHC又称为人类白细胞抗原(HLA)基因复合体，作为抗原提呈分子参与适应性免疫应答，决定了T细胞识别抗原的MHC限制性。CTL细胞中CD8
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T细胞可以识别MHC I类分子提呈的内源性抗原肽被激活，通过快速且精准的控制过程靶向肿瘤细胞，直接将肿瘤细胞杀死。但由于突变细胞或肿瘤细胞表面的MHC I类分子缺失或表达降低，致使肿瘤细胞不能有效提呈肿瘤抗原，以致不能有效的激活特异性CD8
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CTL以杀伤肿瘤细胞，造成肿瘤免疫逃逸。
[0006]ACT治疗的特异性在很大程度上取决于对特异性肿瘤抗原的识别，尤其是对新抗原的识别。越来越多的证据表明，ACT治疗的成功可能归因于新抗原特异性T细胞，这一策略
已被证明可以成功地诱发肿瘤消退，甚至使转移性癌症患者得到完全缓解。因此，采用这些新抗原特异性的T细胞的ACT将非常有前途。在各种ACT中，肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,TIL)在肿瘤治疗中已经被证明是一种非常成功的方法。由肿瘤组织中分离得到的TIL含有多种具有不同受体的肿瘤特异性T细胞，这些肿瘤特异性T细胞主要识别由癌细胞基因突变引起的新抗原，并可以对多种肿瘤抗原产生反应，应对肿瘤的异质性。越来越多的研究注意力已经转移到识别和选择新抗原特异性T细胞上，这种“精准靶向”策略对新抗原特异性T细胞的鉴定和分离提出了巨大的挑战。如何从TIL中有效地识别和分离肿瘤抗原特异性T细胞并有效识别由癌细胞基因突变引起的新抗原，很大程度上决定了TIL细胞靶向肿瘤细胞及杀伤肿瘤细胞的能力。
[0007]长期以来，研究人员一直试图从输注的TIL中分离肿瘤抗原特异性T细胞亚群，并为此开发了许多方法。目前已知分离肿瘤抗原特异性T细胞的策略包括:1)通过全外显子测序，肿瘤细胞cDNA文库测序及与HLA I类分子分型分析结合的生信分析，推测肿瘤特异性抗原序列，合成预测的抗原肽池筛选肿瘤抗原特异性T细胞；2)通过全外显子测序，筛选编码患者肿瘤突变的微小基因串联库(Tandem Minigene,TMG)，可以从治疗性TIL中识别肿瘤新抗原特异性T细胞；3)使用表面标记物或T细胞受体(TCR)序列分析及大数据分析的方法，预测肿瘤抗原特异性T细胞，等等。然而，这些尝试在不同程度上均存在短板，有的方法需要建立自体肿瘤细胞系，因此需要面临建立自体肿瘤细胞系成功率的挑战；如果使用单一细胞表面标记物，有些肿瘤抗原特异性T细胞就会被遗漏；尤其目前最广泛应用的通过测序及生信分析的方法需要较多的肿瘤组织、复杂的设备、数月的时间及昂贵的费用，同时也存在计算机算法可能引入的不准确性及不确定性，与此同时，对于大多数已经发生肿瘤转移的患者来说，这个时间范围是不可接受的，加之巨额的费用，使这些方法的应用面临极大的限制。
[0008]此外，人工抗原呈递细胞(aAPC)目前作为可能的替代品，在癌症免疫疗法的生产中得以应用。目前采用的aAPC是一种仅限于确定和经选择的肽
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MHC复合物的方法，无法应用于未知的肿瘤新抗原的情况。也有研究人员在磁珠上结合已知的、基因工程合成的肽
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MHC复合物以富集/刺激T细胞，但这一过程需要预先鉴定免疫原性肿瘤抗原和体外合成相应的患者特异性MHC
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I类分子结构，同样限制了这个方法在肿瘤免疫治疗临床中的广泛应用。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供一种肿瘤细胞来源的肿瘤抗原/MHC
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I复合物及其制备方法，以最大程度地俘获肿瘤细胞中的特异性肿瘤抗原，可用于富集肿瘤抗原特异性CD8
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T细胞、刺激相同来源肿瘤浸润淋巴细胞的活化、增殖和肿瘤杀伤功能，以解决肿瘤抗原特异性T细胞的“精准靶向”问题。
[0010]本专利技术提供了一种肿瘤抗原/MHC
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I复合物的制备方法，其包括：
[0011]对肿瘤细胞进行裂解，得到肿瘤细胞裂解物，所述肿瘤细胞裂解物含有肿瘤抗原/MHC
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I复合物；
[0012]将负载有抗体的载体与所述肿瘤细胞裂解物混合处理，得到所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物；其中，所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物负载于所述载体上，所述抗体与所述肿瘤抗原/
MHC
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I复合物中的MHC
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I特异性结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.肿瘤抗原/MHC
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I复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：对肿瘤细胞进行裂解，得到肿瘤细胞裂解物，所述肿瘤细胞裂解物含有肿瘤抗原/MHC
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I复合物；将负载有抗体的载体与所述肿瘤细胞裂解物混合处理，得到所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物；其中，所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物负载于所述载体上，所述抗体与所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物中的MHC
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I特异性结合。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括从负载有所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物的载体中分离所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物的步骤。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，以细胞裂解液对所述肿瘤细胞进行裂解；优选地，所述细胞裂解液包括3
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[3
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(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、Tris缓冲液和NaCl；和/或所述抗体为MHC
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Iβ链抗体；优选地，所述抗体标记有第一标记物，所述第一标记物选自生物素和/或第一化学偶联物；和/或所述载体为磁珠和/或量子点荧光微球；优选地，所述载体标记有第二标记物，所述第二标记物选自亲和素和/或第二化学偶联物。4.一种肿瘤抗原/MHC
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I复合物，其特征在于，通过权利要求1
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3任一项所述制备方法制备得到。5.权利要求4所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物在体外富集肿瘤抗原特异性CD8
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T细胞、刺激相同来源肿瘤浸润淋巴细胞的活化、增殖和/或制备治疗肿瘤的药物中的用途。6.一种体外富集肿瘤抗原特异性CD8
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T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求4所述肿瘤抗原/MHC
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I复合物与相同来源的肿瘤浸润淋巴细胞接触，所述肿瘤浸润淋巴细胞中的肿...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文静，李斌，高青，
申请(专利权)人：青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司，
类型：发明
国别省市：