本发明专利技术提供了一种提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化TIL细胞及其应用。本发明专利技术涉及基因工程及细胞治疗技术领域。本发明专利技术的工程化TIL细胞表面含有外源的膜结合型的DAP10‑CD3ζ融合蛋白，其内质网或高尔基体中含有滞留型融合蛋白。具体地，本发明专利技术提供了一种膜结合型DAP10‑CD3ζ融合蛋白，使TIL细胞通过NKG2D‑NKG2DL途径识别肿瘤细胞后，可以被本发明专利技术的激活型融合蛋白激活，从而对肿瘤细胞进行有效杀伤。本发明专利技术还提供了滞留型融合蛋白，使TIL细胞激活时表达的内源NKG2DL能与本发明专利技术的滞留型融合蛋白结合，从而滞留在细胞内，避免了TIL细胞间的相互识别和杀伤，提升了TIL细胞的活率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及细胞治疗，具体地涉及提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化til细胞及其应用。
技术介绍
1、肿瘤浸润淋巴细胞(til)细胞疗法是指从肿瘤组织中分离肿瘤浸润的淋巴细胞，在体外培养和大量扩增后回输到病人体内的疗法。til由具有多种个tcr克隆的t细胞组成，可以识别多个肿瘤特异性的新生抗原及肿瘤相关抗原，使其更有效地应对肿瘤异质性。til通常含有一定效应性记忆性t细胞，在体内被肿瘤抗原刺激后表达趋化因子受体，使其在回输后更容易定位于肿瘤组织。此外，til来源于患者自身，具有较低的毒性。til疗法在实体瘤领域内表现出了巨大的潜力。
2、来源肿瘤组织的til细胞富含肿瘤特异性t细胞，然而，这些肿瘤特异性t细胞在肿瘤特异性激活后往往处于终末分化、耗竭状态，导致til细胞对肿瘤细胞的杀伤能力减弱。此外，培养出来的til细胞中有大部分细胞是非肿瘤特异性的旁观者细胞，如何将旁观者细胞转变为对肿瘤细胞具有识别和杀伤功能的效应细胞是亟待解决的问题。此外，肿瘤细胞往往降低mhc-i分子的表达或tap基因突变等导致抗原递呈功能丧失等，从而逃逸免疫细胞的杀伤。
3、til细胞表面的nkg2d分子可以结合肿瘤细胞表面的nkg2dl分子，从而使til细胞识别肿瘤细胞。然而，til细胞在激活状态下会短暂表达nkg2dl，这使得til细胞之间存在互相残杀，导致til细胞活力显著下降。
4、因此，本领域迫切需要开发对肿瘤细胞具有识别和杀伤肿瘤细胞功能、减少免疫逃逸、并能减少til细胞自相残杀的工程化til细胞。</p>
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是提供对肿瘤细胞具有识别和杀伤肿瘤细胞功能、减少免疫逃逸、并能减少til细胞自相残杀的工程化til细胞及其应用。
2、在本专利技术的第一方面，提供了一种工程化肿瘤浸润淋巴细胞(til细胞)，所述工程化til细胞表达选自下组的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滞留型融合蛋白、或其组合；
3、其中，所述激活型融合蛋白为膜结合型dap10-cd3ζ融合蛋白；
4、所述滞留型融合蛋白包括：nkg2d胞外区和kdel序列。
5、在另一优选例中，所述工程化til细胞表达激活型融合蛋白和滞留型融合蛋白。
6、在另一优选例中，所述激活型融合蛋白包括：(1) 胞外结构域，所述胞外结构域包含dap10元件或其活性片段；
7、(2) 跨膜域；和
8、(3) 胞内信号域，所述胞内信号域包含dap10胞内结构域和cd3ζ；
9、其中，所述胞外结构域和胞内信号域，通过所述跨膜域串联在一起。
10、在另一优选例中，所述的工程化til细胞的细胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化til细胞的内质网或高尔基体中具有所述的滞留型融合蛋白。
11、在另一优选例中，所述工程化til细胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的激活型融合蛋白和/或所述的滞留型融合蛋白。
12、在另一优选例中，所述工程化til细胞含有一核酸构建物，所述核酸构建物包含第一表达盒，所述第一表达盒包含编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
13、在另一优选例中，所述工程化til细胞含有一载体，所述载体包含：编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
14、在另一优选例中，所述工程化til细胞还表达膜结合型il-15融合蛋白，其包括以下元件：
15、(i) 白细胞介素15或其功能活性片段；
16、(ii) 跨膜域；和
17、(iii) 胞内域；
18、其中，所述胞内域为cd86胞内域。
19、在另一优选例中，所述cd86胞内域包括全长胞内域、或其活性片段。
20、在另一优选例中，所述il-15包括全长的、成熟形式的il-15、或其活性片段。
21、在另一优选例中，所述il-15包括野生型和突变型。
22、在另一优选例中，所述il-15的氨基酸序列如seq id no: 6所示。
23、在另一优选例中，所述融合多肽进一步包括铰链区。
24、在另一优选例中，所述融合多肽进一步可选地包括信号肽和/或连接子(linker)。
25、在另一优选例中，所述连接子位于所述元件(i)和元件(ii)之间，元件(ii)和元件(iii)之间，元件(i)和铰链区之间，或者铰链区和元件(ii)之间。
26、在另一优选例中，所述连接子包括柔性连接子或刚性连接子。
27、在另一优选例中，所述连接子的氨基酸序列如为seq id no: 7所示。
28、在另一优选例中，所述融合多肽的结构式如式(i)所示：
29、x-il15-l-h-tm-cyto (i)
30、其中，
31、“-”各自独立地为无或连接肽；
32、x为无或信号肽；
33、il15为白细胞介素15元件；
34、l为无或连接子；
35、h为铰链区；
36、tm为跨膜域；
37、cyto为胞内域，其中所述胞内域为cd86胞内域。
38、在另一优选例中，所述跨膜域为cd86跨膜域。
39、在另一优选例中，所述cd86跨膜域和胞内域的氨基酸序列如seq id no: 9所示。
40、在另一优选例中，所述铰链区为cd86铰链区，优选地，所述cd86铰链区的氨基酸序列如seq id no: 7所示。
41、在另一优选例中，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no: 5所示。
42、在另一优选例中，所述工程化til细胞具有选自下组的一个或多个性能：
43、(1) 增强的识别和杀伤肿瘤细胞的能力；
44、(2) 减少激活的til细胞间相互识别和杀伤的能力；
45、(3) 扩大的til细胞识别靶抗原谱；
46、(4) 有效防止肿瘤的免疫逃逸和复发。
47、在本专利技术第二方面，提供了一种激活型融合蛋白，所述激活型融合蛋白包括：
48、(1) 胞外结构域，所述胞外结构域包含dap10元件或其活性片段；
49、(2) 跨膜域；和
50、(3) 胞内信号域，所述胞内信号域包含dap10胞内结构域和cd3ζ；
51、其中，所述胞外结构域和胞内信号域，通过所述跨膜域串联在一起。
52、在另一优选例中，在胞内信号域中，dap10胞内结构域和cd3ζ直接相连或通过连接肽连接。(较佳地，所述连接肽的长度为1-10aa，较佳地1-6aa，更佳地1-3aa)。
53、在另一优选例中，所述胞内信号域进一步包括共刺激域。
54、在另一优选例本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞表达选自下组的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滞留型融合蛋白、或其组合；
2. 如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述激活型融合蛋白包括：(1)胞外结构域，所述胞外结构域包含DAP10元件或其活性片段；
3.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述的工程化TIL细胞的细胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化TIL细胞的内质网或高尔基体中具有所述的滞留型融合蛋白。
4.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的激活型融合蛋白和/或所述的滞留型融合蛋白。
5.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞含有一核酸构建物，所述核酸构建物包含第一表达盒，所述第一表达盒包含编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
6.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞含有一载体，所述载体包含：编码所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或编码所述的滞留型融合蛋白的多核苷酸。
7.如权利要求1所述的工程化TIL细胞，其特征在于，所述工程化TIL细胞还表达膜结合型IL-15融合蛋白，其包括以下元件：
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的工程化TIL细胞和药学上可接受的载体。
9. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的工程化TIL细胞，或用于制备权利要求1所述的工程化TIL细胞的试剂，其中，所述试剂选自下组：
10.权利要求1所述的工程化TIL细胞、或权利要求9所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。
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【技术特征摘要】
1.一种提高识别和杀伤肿瘤能力的工程化til细胞，其特征在于，所述工程化til细胞表达选自下组的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滞留型融合蛋白、或其组合；
2. 如权利要求1所述的工程化til细胞，其特征在于，所述激活型融合蛋白包括：(1)胞外结构域，所述胞外结构域包含dap10元件或其活性片段；
3.如权利要求1所述的工程化til细胞，其特征在于，所述的工程化til细胞的细胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化til细胞的内质网或高尔基体中具有所述的滞留型融合蛋白。
4.如权利要求1所述的工程化til细胞，其特征在于，所述工程化til细胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的激活型融合蛋白和/或所述的滞留型融合蛋白。
5.如权利要求1所述的工程化til细胞，其特征在于，所述工程化til细胞含有一核酸构建物，所述核酸构建物包含第一表达盒，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：许傲天，于忠杰，蒋彬，朱月姝，邵琳，李斌，宋宇，孙振，刘文娜，吴昊，赵毅，高青，
申请(专利权)人：青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司，
类型：发明
国别省市：
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