共表达CD45和EpCAM的细胞群的检测和分离方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种共表达CD45和EpCAM的细胞群的检测和分离方法及其用途。本发明专利技术将包含抗CD45抗体和抗EpCAM抗体的组合物或试剂盒用于从PBMC中检测和分离共表达CD45和EpCAM的细胞群，并用于癌症的快速体外筛查、指导癌症的治疗以及癌症治疗有效性的评估。疗以及癌症治疗有效性的评估。

【技术实现步骤摘要】
共表达CD45和EpCAM的细胞群的检测和分离方法及其用途


[0001]本专利技术涉及细胞免疫学领域，尤其涉及一种基于抗CD45抗体和抗EpCAM抗体的组合物、相应的试剂盒及其在从外周血单个核细胞(PBMC)中检测和分离共表达CD45和EpCAM的细胞群中的用途。还涉及将共表达CD45和EpCAM的细胞群用于癌症的体外筛查、治疗的指导以及治疗有效性的评估。

技术介绍

[0002]癌症是一种威胁人类健康的肿瘤，在全球范围内其发病率和死亡率迅速增长。2018年全世界新增1,810万新发病例和960万癌症死亡病例，其中肺癌的发病率及死亡率位居首位(Bray et al.,2018)。肺癌作为第一大癌症杀手，发病隐匿、诊断不及时、易转移复发、预后极差，而且70
‑
75％的患者发展到晚期才被发现，大大降低了生存率。通常利用常规组织病理学检查无法检测到患者体内原发性肿瘤细胞的扩展。近年来发现循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)可以用于早期诊断，可作为早期筛查的辅助方法，并可用于识别肿瘤切除后的患者是否需要进一步全身治疗。
[0003]CTC是指原发肿瘤或转移病灶内的肿瘤细胞通过主动迁移、侵袭或者外在因素干扰导致其脱落，从而进入循环血液所形成(King et al.,2015；Lin et al.,2014)。1869年，澳大利亚Ashworth医生通过显微镜在因癌症死亡的患者外周血中发现了与原发肿瘤类似的细胞，并首次提出了CTC的概念(Ashworth,1869)。CTC的存在是癌症转移和降低生存率的一个重要危险因素。CTC作为液体活检的靶点，其结果能够反映原发性和转移性病变的特征。因此，在肺癌诊疗中CTC检测、计数及表型分析逐渐成为当前研究的热点和焦点，其在早期诊断、疗效评价、预后预测以及指导个体化治疗等方面有重要价值。
[0004]在肺癌筛查方面，常用的低剂量螺旋CT(LDCT)、肿瘤自身抗体、肿瘤标志物等方法尚不能单独精准地鉴别肿瘤的良恶性，例如最常应用的LDCT，由于在影像学中肺小结节呈现出多样性的特点，异病同影/同病异影给鉴别肿瘤良恶性造成很大困难，从而导致较高的假阳性率、过度诊断、延误诊断、随访复查加剧患者焦虑心理、影响患者正常工作生活。此外，它还存在医源辐射、筛查费用高等弊端。理论上讲，早期肺癌患者，甚至在肺内尚未形成微小病灶之前，外周血中已存在CTC，其难点在于寻找灵敏性、特异性较高的有效的检测手段。
[0005]CTC进入外周血后，大部分发生凋亡或被吞噬，只有少数能够逃逸并发展成为转移灶。研究表明，体积为1cm3(约1g湿重)大小的肿瘤通常包含1x109个细胞，每日约有106个细胞入血(Chang et al.,2000)。
[0006]在循环血液中CTC数量常呈现出动态递减的特点，到达外周血时已十分稀少。据研究，每106‑
107个白细胞中才可以检测到1个肿瘤细胞(Paterlini
‑
Brechot and Benali,2007；Sleijfer et al.,2007)。因此，要从数以千万计以上背景的细胞中精准地检测到CTC并非易事，这是限制其在临床上发挥作用的主要原因。目前的主流理念是先对外周血中的肿瘤细胞进行富集，然后对其进行检测。富集方法主要是利用肿瘤细胞表面的分子标志物
或物理特性来进行。后续的检测包括实时定量反转录PCR(Quantitative Reverse
‑
transcription PCR,qRT
‑
PCR)等基因水平的检测；流式细胞检测技术(Flow Cytometry,FCM)、CellSearch、CTC芯片(CTC
‑
chip)等细胞水平的检测。
[0007]虽然用于临床研究的CTC分离和富集技术很多，但是目前来说仍普遍存在取样量大、灵敏度差、特异性低、操作繁琐、成本高昂等缺点，如密度梯度离心法要求血量较大；ISET灵敏度低；3D微型过滤器价格昂贵、血液需要稀释；qRT
‑
PCR法由于不同的CTC之间肿瘤标志物的表达水平不同，因而其标志物的含量与实际个体并不总是具有正相关性；CellSearch检测过程操作繁琐等。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供了包含抗CD45抗体和抗EpCAM抗体的组合物及相应的试剂盒，以及将该组合物和试剂盒在从外周血单个核细胞(PBMC)中检测和分离共表达CD45和EpCAM的细胞群中的用途；还提供了一种共表达CD45和EpCAM的细胞群及其用途。本专利技术旨在提供一种更加高效的检测方法，所检测到的细胞群可以更加准确地用于癌症的筛查、辅助诊断、疗效检测等，解决了目前检测CTC时存在的取样量大，分离/富集/鉴别困难的问题。
[0009]一方面，本专利技术提供了一种组合物，所述组合物包含抗CD45抗体和抗EpCAM抗体。
[0010]另一方面，本专利技术还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本专利技术所述的组合物。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了所述组合物或所述试剂盒在从外周血单个核细胞中检测和/或分离共表达CD45和EpCAM的细胞群中的用途。
[0012]另一方面，本专利技术还提供了一种共表达CD45和EpCAM的细胞群的分离方法，包括：
[0013]提供外周血单个核细胞；
[0014]将本专利技术所述的组合物或本专利技术所述的试剂盒与所述外周血单个核细胞混合，孵育所得混合物；
[0015]向所述混合物加入磁珠，经孵育，得到结合有共表达CD45和EpCAM的细胞群的磁珠；
[0016]去除磁珠，得到共表达CD45和EpCAM的细胞群。
[0017]另一方面，本专利技术还提供了一种共表达CD45和EpCAM的细胞群，所述细胞群通过本专利技术所述的分离方法获得。
[0018]另一方面，本专利技术还提供了所述共表达CD45和EpCAM的细胞群在筛查和/或指导癌症治疗中的用途。
[0019]另一方面，本专利技术还提供了一种癌症的体外筛查方法，包括：
[0020]取受试者的外周血单个核细胞；
[0021]通过本专利技术所述的分离方法分离所述受试者的共表达CD45和EpCAM的细胞群；
[0022]当所述共表达CD45和EpCAM的细胞群的细胞数占所述外周血单个核细胞的细胞数的比例高于0.01％时，应进行进一步的诊断和/或治疗。
[0023]另一方面，本专利技术还提供了另一种癌症的体外筛查方法，包括：
[0024]取受试者的外周血单个核细胞；
[0025]将本专利技术所述的组合物或本专利技术所述的试剂盒与所述外周血单个核细胞混合，孵育所得混合物；
[0026]检测所述混合物中共表达CD45和EpCAM的细胞群；
[0027]当所述共表达CD45和EpCAM的细胞群的细胞数占所述外周血单个核细胞的细胞数的比例高于0.01％时，应进行进一步的诊断和/或治疗。
[0028]另一方面，本专利技术还提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含抗CD45抗体和抗EpCAM抗体。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CD45抗体为大鼠源抗人CD45单抗、小鼠源抗人CD45单抗、羊源抗人CD45单抗和兔源抗人CD45单抗；和/或所述抗EpCAM抗体选自大鼠源抗人EpCAM单抗、小鼠源抗人EpCAM单抗、羊源抗人EpCAM单抗和兔源抗人EpCAM单抗。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述抗CD45抗体的亲和力大于1.0
×
10
‑
11
mol；和/或所述抗EpCAM抗体的亲和力大于等于2.69
×
10
‑
10
mol/L。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的组合物，其特征在于，所述抗CD45抗体和所述抗EpCAM抗体分别与生物素或荧光素偶联。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的组合物，其特征在于，所述抗CD45抗体与所述抗EpCAM抗体的质量比为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙振，李斌，李文静，赵明明，王泽瑶，刘文娜，高青，
申请(专利权)人：青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司，
类型：发明
国别省市：