本发明专利技术涉及合成的肝特异性启动子和表达构建体，用于在受试者的肝脏中生成多核苷酸和功能性核酸。本发明专利技术还涉及编码因子IX蛋白质的优化的多核苷酸序列、包含该序列的载体以及使用这些组合物治疗出血性疾病的方法。用这些组合物治疗出血性疾病的方法。用这些组合物治疗出血性疾病的方法。
【技术实现步骤摘要】
优化的人凝血因子IX基因表达盒及其应用
[0001]优先权声明
[0002]本申请要求于2017年5月31日提交的美国临时申请第62/512,833号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]本专利技术涉及用于在受试者的肝脏中生成多肽和功能性核酸的合成肝脏特异性启动子和表达构建体。本专利技术还涉及编码因子IX(Factor IX)蛋白的优化的多核苷酸序列、包含所述优化的多核苷酸序列的载体以及使用这些组合物以治疗出血性疾病的方法。
技术介绍
[0004]通过加速因子X转化为因子Xa，因子IX(FIX)在凝血级联中起关键作用。FIX活性不足是出血性疾病血友病B的原因。血友病B的现有治疗方法是静脉输注血浆来源或重组的FIX蛋白。尽管这种治疗在控制出血事件方面很有效，但是由于FIX半衰期短(8
‑
12小时)，进行频繁输注使该方法自身成本高昂。基因疗法已经成为最终治愈这种疾病的有吸引力的策略。然而，由于FIX表达水平不足，因此使用最有前景的病毒载体之一腺病毒伴随病毒(adeno
‑
associated virus)(AAV)递送FIX基因的进展不太理想。
[0005]通过提供适于在AAV载体上使用的的短的合成肝脏特异性启动子和表达构建体，本专利技术克服了在该领域的不足之处。本专利技术还提供了能够生成在延长的时间段内具有超生理学水平的FIX的优化的FIX编码序列以及其在治疗出血性疾病的方法中的用途。
技术实现思路
[0006]本专利技术部分基于长度小于200个碱基对的合成的肝脏特异性启动子的开发。所述启动子可以用于以肝特异性方式(尤其是使用AAV载体)生成多肽和功能性核酸，所述多肽和功能性核酸具有严格的长度限制并具有短而强的启动子的可用性的有益效果。
[0007]本专利技术还部分基于开发了能够生成在延长的时间段内具有超生理学水平的FIX的优化的FIX编码序列。
[0008]在一个方面，本专利技术涉及包含合成的肝脏特异性启动子的多核苷酸，其中启动子包含核苷酸序列SEQ ID NO：1或与其具有至少90％同一性的序列。
[0009]在另一方面，本专利技术涉及编码人凝血因子IX的多核苷酸序列，该序列已进行了密码子优化以在人体中表达。
[0010]在另一方面，本专利技术涉及包含本专利技术的多核苷酸的载体、细胞和/或转基因动物。
[0011]在又一方面，本专利技术涉及在受试者的肝脏中生成多肽或功能性核酸的方法，包括向受试者递送本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞，从而在受试者的肝脏中生成多肽或功能性核酸。
[0012]在另一方面，本专利技术涉及治疗受试者的血友病B的方法，包括向受试者递送治疗有效量的本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞，从而治疗受试者的血友病B。
[0013]在另一方面，本专利技术涉及提高受试者因子IX多肽的生物利用度的方法，包括向受试者递送有效量的本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞，从而提高受试者的因子IX多肽的生物利用度。
[0014]在又一方面，本专利技术涉及本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞在用于在受试者的肝脏中生成多肽或功能性核酸的方法中的用途。
[0015]在另一方面，本专利技术涉及本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞在用于治疗受试者的血友病B的方法中的用途。
[0016]在另一方面，本专利技术涉及本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞在用于提高受试者的因子IX多肽的生物利用度的方法中的用途。
[0017]在又一方面，本专利技术涉及本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞在用于制备在受试者的肝脏中生成多肽或功能性核酸的药物中的用途。
[0018]在另一方面，本专利技术涉及本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞在用于制备治疗受试者的血友病B的药物中的用途。
[0019]在另一方面，本专利技术涉及本专利技术的多核苷酸、载体和/或转化的细胞在用于制备提高受试者的因子IX多肽的生物利用度的药物中的用途。
[0020]本专利技术的这些方面和其他方面将在下文中进行更详细地阐述。
附图说明
[0021]图1示出了LXP2.1启动子(SEQ ID NO：1)的结构和序列。假定的肝脏看家内转录因子(putative hepatic house
‑
keeping transcriptional factor)结合位点以下划线突出显示。
[0022]图2示出了优化的肝脏特异性人因子IX(FIX)基因表达盒的构建过程。
[0023]图3示出了质粒转染48小时后在Huh7细胞培养基中的FIX活性。Huh7肝癌细胞接种在6孔板中并用2μg FIX基因表达构建体转染。24小时后改变细胞培养基，在无血清Opti
‑
MEM培养基中转染48小时后收获。通过APTT测试来测量FIX活性，用纯化的正常FIX蛋白作为参照标准。Wt FIX基因表达构建体含有原始的人FIX cDNA，所述人FIX cDNA没有被密码子优化但含有R338L突变。Opti
‑
FIX
‑
1、2、3基因表达构建体全都含有R338L突变，但具有不同的人密码子优化算法，如实施例1中所描述的。
[0024]图4示出了在FIX基因KO小鼠模型中AAV8
‑
LXP2.1
‑
opti
‑
FIX
‑
1载体剂量递增后强力且长期的因子IX表达和凝血活性分析。
具体实施方式
[0025]现在参考附图更详细地描述本专利技术，在附图中示出了本专利技术的优选实施方案。然而，本专利技术可以以不同的形式实施并且不应该被解释为限于本文所阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本专利技术的公开深入和完整，并将本专利技术的范围向本领域技术人员完整地表述出来。
[0026]除非上下文另有说明，否则很明显地，本文所述的本专利技术的各个特征可以以任何组合使用。此外，本专利技术还考虑在本专利技术的一些实施方案中可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书声明复合体包含组分A、B和C，则明显地是指A、
B或C中的任何一个或其组合可以单独或以任何组合形式被省略和放弃。
[0027]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解所相同的含义。在本专利技术的描述中使用的术语仅是用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本专利技术。
[0028]除非另外特别说明，否则在本文中的核苷酸序列仅以单链表示，在5'至3'方向，从左至右。本文中核苷酸和氨基酸以IUPAC
‑
IUB生物化学命名委员会(IUPAC
‑
IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的方式表示，或(对于氨基酸)通过单字母密码或三字母密码表示，均与37C.F.R.
§
1.822和已建立的用法一致。
[0029]除非另外说明，否本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，其编码已被密码子优化以用于在人体中表达的人因子IX。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，包含核苷酸序列SEQ ID NO:14或者与其具有至少约90％同一性的序列。3.根据权利要求1所述的多核苷酸，包含核苷酸序列SEQ ID NO:15或者与其具有至少约90％同一性的序列。4.根据权利要求1所述的多核苷酸，包含核苷酸序列SEQ ID NO:16或者与其具有至少约90％同一性的序列。5.根据权利要求1所述的多核苷酸，进一步包含合成的内含子。6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述合成的内含子包含核苷酸序列SEQ ID NO:5或者与其具有至少约90％同一性的序列。7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述密码子优化的因子IX编码序列和合成的内含子包含核苷酸序列SEQ ID NO:6或者与其具有至少约90％同一性的序列。8.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述密码子优化的因子IX编码序列和合成的内含子包含核苷酸序列SEQ ID NO:7或者与其具有至少约90％同一性的序列。9.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述密码子优化的因子IX编码序列和合成的内含子包含核苷酸序列SEQ ID NO:8或者与其具有至少约90％同一性的序列。10.一种载体，其包含权利要求1
‑
9中任一项所述的多核苷酸。11.根据权利要求10所述的载体，其中所述载体是病毒载体。12.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体是腺伴随病毒(AAV)载体。13.根据权利要求12所述的载体，其中所述AAV载体是AAV8或AAV9载体。14.一种转化的细胞，其包含权利要求1
‑
9中任一项所述的多核苷酸和/或权利要求10
‑
13中任一项所述的载体，其中所述转化的细胞不为生殖细胞和受精卵。15.一种组合物，其包含权利要求1
‑
...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖啸，李娟，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学教堂山分校，
类型：发明
国别省市：
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