OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及水稻OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用，本申请研究的是水稻OsAP79基因对水稻褐飞虱抗性作用。本发明专利技术通过在OsAP79基因上游加入CaMV35S启动子，构建OE超表达载体转化感虫水稻品种，使得OsAP79基因大量转录和翻译，实现基因产物的过表达，增强水稻对褐飞虱的抗性。证明OsAP79可以通过将该片段加入CaMV35S启动子转入植物体，转基因植物对褐飞虱的抵抗能力显著增强。因植物对褐飞虱的抵抗能力显著增强。因植物对褐飞虱的抵抗能力显著增强。

【技术实现步骤摘要】
OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用。

技术介绍

[0002]水稻虫害每年都造成巨大的产量损失，褐飞虱是水稻生产危害最严重的虫害之一。发掘水稻抗褐飞虱基因和相关抗虫机理是迄今最经济且有效控制该虫害的举措。
[0003]褐飞虱属于同翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)昆虫，是水稻中典型的刺吸式昆虫类型。它利用其口器直接刺穿水稻植株的维管束韧皮部并吸取汁液。同时，它又属于宿主专一性的昆虫类型。当褐飞虱直接危害处于苗期阶段的水稻时，它可导致植株体内大量的营养物质丧失，从而引起叶片变黄，植株生长迟缓且矮小，最后可能导致植株死亡等性状。若褐飞虱危害处于孕穗或抽穗阶段的水稻后，植株的叶片也会变黄变枯直至出现植株倒伏现象，危害严重时田间还会呈现飞虱火烧(
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)的现象。近年来，随着分子标记的发展和水稻高密度连锁图谱的构建，分别在水稻第2、3、4、6、11和12染色体定位了多个水稻抗褐飞虱主基因，并克隆了多个水稻抗褐飞虱主效基因。此外，研究人员也发掘多个抗褐飞虱相关基因并初步研究其功能。
[0004]天冬氨酸蛋白酶(AP)是四大蛋白水解酶家族非常重要的亚家族成员，参与机体的代谢和生物调控作用。APs普遍存在于动物和植物细胞中,而且在植物不同器官中表达，比如种子、茎、叶片、花器官等。近年来，越来越多分离的植物天冬氨酸蛋白酶通过体内实验对其功能进行了探究。目前在模式植物拟南芥和水稻基因组中分别发现69和96个APs基因。植物中的APs主要参与前体蛋白的加工、蛋白质的降解、细胞程序性死亡等过程，同时也参与植物抗病、抗逆、叶片衰老等过程。早在20世纪90年代，Rodrigo等在烟草和番茄叶片中分离出了定位于胞外的APs，它们与病程相关蛋白的降解有关。某些水稻AP基因也参与了生物胁迫应答。水稻经植物抗病诱导剂水杨酸和苯并噻二唑(BTH)处理后OsCDR1的表达量显著上调，说明OsCDR1可能与水稻抗病有关。为研究OsAP77基因的功能，对水稻植株进行了多种处理。发现经细菌、真菌、病毒等感染后，水稻维管组织中的OsAP77表达明显增强。尽管有很多研究表明AP基因参与了多种生物学功能，但在植物中尚未有该家族基因参与抗虫功能的研究报道。

技术实现思路

[0005]鉴于研究进展，有必要提供OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用，该研究能阐述OsAP79在水稻抗褐飞虱中的作用，为水稻抗性育种利用OsAP79基因提供理论基础。
[0006]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]OsAP79基因在诱导水稻褐飞虱抗性中的应用，所述OsAP79基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]进一步的，所述OsAP79基因的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步的，所述水稻为伏令夏橙。
[0010]本专利技术还包括过表达OsAP79基因在提高水稻褐飞虱抗性中的应用，所述过表达载体含有上述的核酸序列。
[0011]本专利技术还包括一种构建过量表达OsAP79基因载体的方法，具体步骤如下：
[0012](1)根据OsAP79基因编码区，设计基因特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，克隆OsAP79基因的完整CDS区，琼回收纯化PCR扩增产物；
[0013](2)将步骤(1)的扩增产物克隆到由CaMV35S启动子控制的载体名称为pCAMBIA1301A的大肠杆菌中，经过检测和测序后提取质粒即得过表达OsAP79基因的载体。
[0014]本专利技术还包括一种应用所述过表达OsAP79基因诱导水稻褐飞虱抗性的研究，所述方法包括如下步骤：
[0015](1)通过化学转化法，将权利要求4构建好的过量表达载体转化农杆菌感受态细胞EHA105；
[0016](2)用步骤(1)所得得含有目的质粒的农杆菌对水稻的植株进行侵染。
[0017]本专利技术还包括一种获得抗褐飞虱的水稻育种方法，所述方法为：构建水稻OsAP79基因的过量表达载体，通过农杆菌介导法将OsAP79基因转入到水稻的基因组中，获得具有抗褐飞虱的转基因植株。
[0018]本专利技术具有如下有益效果：
[0019]本专利技术分析了抗性、感性材料在褐飞虱取食前后的转录组分析，基因Os10g39300在抗虫品种中显著上调，结合PCR(polymerase chain reaction)技术分离获得了OsAP79基因；通过褐飞虱接虫处理后的9311感性植株和RBPH16抗性植株进行转录组分析植株内源Os10g39300的表达，确定Os10g39300的表达受到褐飞虱侵染后的诱导；利用转基因技术验证OsAP79基因的生物学功能，发现OsAP79基因在水稻对褐飞虱的抗性中发挥着重要作用。
【附图说明】
[0020]图1：含OsAP79基因的水稻遗传转化质粒T
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DNA框结构示意图；
[0021]图2：以日本晴(NIP)为背景的过表达转基因T0植株OsAP79基因的表达情况；
[0022]图3：OsAP79基因过表达和敲除后T2家系和日本晴(NIP)的苗期褐飞虱抗性比较结果图；图中，A为水稻苗期接种褐飞虱的初始状态，B为接种褐飞虱后植株的生长状态，C为不同家系植株的OsAP79基因的表达情况结果图；图A
‑
C从左到右依次为：感病植株(NIP)、两个过表达OsAP79基因家系植株、两个敲除OsAP79基因家系植株；
[0023]图4：水稻种接种褐飞虱的初始状态；盆中的3株苗从左到右依次为：过表达OsAP79基因家系植株(OE)、感病品种(NIP)、敲除OsAP79基因家系植株；
[0024]图5：水稻接种褐飞虱后的成株期状态；盆中的3株苗从左到右依次为：过表达OsAP79基因家系植株(OE)、感病品种(NIP)、敲除OsAP79基因家系植株；
[0025]图6：为不同家系植株的OsAP79基因的表达情况结果图；从左到右依次为：感病品种(NIP)的表达情况、2
‑
3为过表达OsAP79基因的表达情况、4
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5为敲除OsAP79基因的表达情况。
【具体实施方式】
[0026]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术
的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。
[0027]实施例1：
[0028]植物抗虫相关基因的发现：
[0029]为发掘水稻抗褐飞虱相关基因，通过对接虫24h后的抗虫品种RBPH16和感虫品种9311进行了转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.OsAP79基因诱导水稻褐飞虱抗性的应用，其特征在于，所述OsAP79基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的OsAP79基因在诱导水稻褐飞虱抗性中的应用，其特征在于，所述OsAP79基因的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。3.过表达OsAP79基因诱导水稻褐飞虱抗性的应用，其特征在于，所述过表达载体含有如权利要求1所述的核酸序列。4.一种构建如权利要求4所述过表达OsAP79基因的载体构建的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据OsAP79基因编码区，设计基因特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，克隆OsAP79基因的完整CDS区，琼回收纯化PCR扩增产物；...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱永福，李晶莹，曹振宇，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：