青虾legumain-like基因及其dsRNA的应用制造技术

本发明专利技术公开了青虾Legumain

【技术实现步骤摘要】
青虾legumain
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like基因及其dsRNA的应用


[0001]本专利技术涉及青虾legumain
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like基因及其dsRNA的应用，属于生物


技术介绍

[0002]青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)隶属于长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，体色呈青灰色并有棕色斑纹，由此而得名，又俗称为河虾。自然分布于中国、日本、韩国、朝鲜、老挝、马来西亚、缅甸(缅甸大陆)、越南以及俄罗斯远东地区，逐渐扩散到新加坡、菲律宾、乌兹别克斯坦、伊拉克南部以及摩尔多瓦、哈萨克斯坦、伊朗等地。青虾是我国重要的经济淡水养殖品种，但是一直受“性快熟”问题的困扰。“性快熟”指的是雌虾在繁育季节繁殖多代。这一现象会引起多代同堂，养殖密度过高、饲料消耗量增大、缺氧问题严重等问题出现。所以，解决这一问题对于提高青虾产量，促进青虾产业健康快速发展具有重要意义。
[0003]天冬酰胺内肽酶(legumain，LGMN)是半胱氨酸蛋白酶家族的新成员。最早在植物刀豆和豇豆中发现，随后研究人员发现在脊椎动物、哺乳动物中均有legumain的表达。legumain和其他家族的组织蛋白酶一样，主要定位于细胞的溶酶体中，参与降解基质蛋白等多种生理过程。然而关于legumain在机体正常发育过程中和正常组织中的作用研究相对较少。本研究以青虾作为研究对象，研究legumain
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like在卵巢成熟发育过程中的作用。/>[0004]RNAi(RNA interference,RNAi)技术它是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达，从而抑制或关闭特定基因表达的现象。在已发表的研究中有提及到在青虾体内通过干扰卵黄蛋白等基因来抑制卵巢发育，所以此项技术对于解决青虾“性快熟”问题具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对雌性青虾“性快熟”问题，通过生物技术手段来减缓卵巢发育成熟的速度，提供一种与雌性青虾卵巢发育相关的靶基因及其dsRNA在抑制青虾卵巢发育的应用。
[0006]本专利技术提供了Legumain
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like基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了所述Legumain
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like基因编码的半胱氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了所述的青虾的Legumain
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like基因或青虾的半胱氨酸蛋白酶作为靶标在抑制青虾卵巢发育或制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。
[0009]本专利技术提供了一种高效的青虾Legumain
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like干扰基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
[0010]本专利技术提供了青虾Legumain
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like干扰基因片段在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。
[0011]本专利技术提供的一种制备青虾Legumain
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like干扰基因片段的方法，所述方法如下：
以青虾总cDNA为模板，利用上游引物SEQ ID NO.4和下游引物SEQ ID NO.5扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的干扰基因片段。
[0012]本专利技术还提供了一种用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA，所述dsRNA是以上述青虾Legumain
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like干扰基因片段为模板体外转录获得。
[0013]本专利技术还提供了所述dsRNA抑制青虾Legumain
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like基因mRNA表达的应用。
[0014]本专利技术还提供了所述dsRNA抑制青虾卵巢发育或制备抑制青虾卵巢发育的产品中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种制备用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA的方法，所述方法为，利以核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因片段为模板转录得到dsRNA。
[0016]本专利技术还提供了一种生物抑制剂，含有上述用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA。
[0017]本专利技术还提供了一种抑制青虾卵巢发育的方法，所述方法为将上述dsRNA或上述生物抑制剂注射至青虾围心腔内，该dsRNA或生物抑制剂可沉默/抑制上述Legumain
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like基因的表达。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述dsRNA或生物抑制剂的注射剂量为3.5～4.5μg/g。
[0019]本专利技术还提供了一种抑制青虾卵巢发育的试剂盒，含有上述dsRNA或上述生物抑制剂。
[0020]上述青虾Legumain
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like基因、上述青虾Legumain
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like基因编码的半胱氨酸蛋白酶、上述青虾Legumain
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like基因片段在青虾养殖方面的应用。
[0021]有益效果：
[0022]1、dsRNA1在肝胰腺和卵巢中的沉默效率达到88.51％～99.41％，有效的抑制了青虾Legumain
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like基因的表达。
[0023]2、注射dsRNA1可以有效降低青虾Legumain
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like基因mRNA的表达，青虾在17天的性腺指数较对照组降低了50％，抑制了青虾卵巢发育速度。
附图说明
[0024]图1.注射dsRNA后卵巢、肝胰腺中Legumain
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like基因相对表达量变化图。A图为卵巢中Legumain
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like基因在不同采样时间点的mRNA的表达。B图为肝胰腺中Legumain
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like基因在不同采样时间点的mRNA的表达。青虾EIF基因作为内参基因。1、9、17分别为注射后第1天、第9天、第17天(n＝9)。不同字母代表差异显著p<0.05。
[0025]图2.青虾卵巢性腺发育指数变化图。1、9、17分别为注射后第1天、第9天、第17天(n＝9)。不同字母代表差异显著p<0.05。
具体实施方式
[0026]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
[0027]实施例1：获得青虾Legumain
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like基因全长核苷酸序列。
[0028]通过对雌性青虾巢各个发育时期进行转录组比较分析，获得基因Legumain
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like
全长序列。
[0029]实施例2：青虾Legumain
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like基因片段及其dsRNA的获取
[0030]以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的青虾Legumain
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like基因为依据，在其开放阅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.青虾的Legumain
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like基因或青虾的半胱氨酸蛋白酶作为靶标在抑制青虾卵巢发育或制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用；所述Legumain
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like基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.青虾Legumain
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like干扰基因片段在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用；所述Legumain
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like干扰基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。3.一种用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA是以青虾Legumain
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like干扰基因片段为模板体外转录获得；所述Legumain
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like干扰基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。4.权利要求3所述的dsRNA抑制青虾Legumain
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like基因mRNA表达的应用。5.权利要求3所述的dsRNA抑制青虾卵巢发育或制...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔慧，傅洪拓，程丹，张文宜，蒋速飞，熊贻伟，金舒博，龚永生，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：