本发明专利技术公开了一种太子参环化酶phPCY蛋白基因及其应用，具体公开了一种太子参环化酶，其编码太子参环化酶的核苷酸序列如序列表1所示，以及氨基酸序列如列表2所示，使环化酶基因可以在大肠杆菌中表达；同时提供了含有所述氨基酸序列的蛋白表达载体。本发明专利技术还公开了太子参环化酶phPCY在催化线性底物HB环化生成环状HB反应中的应用。HB反应中的应用。HB反应中的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种太子参环化酶蛋白基因及其应用
[0001]本专利技术涉及一种太子参环化酶蛋白基因及其应用，属于合成生物学、基因工程
技术介绍
[0002]太子参为石竹科植物孩儿参的干燥块根，又名米参、四叶参、童参。在其生命周期可合成环肽类、苷类、氨基酸、糖类、挥发性物质、脂肪酸类、磷脂类及醇类等化学成分，具有保护心肌、抗氧化、抗应激、促进免疫等药理作用。环肽是太子参的特色化学成分，环肽作为一类重要的肽类化合物,在生物医学、药学等许多方面有着可观的发展前景。目前已从太子参中分离得到16种太子参环肽类成分：太子参环肽Heterophyllin A
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H及Pseudostellarin A
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H，其生理活性是医药领域研究的热点。
[0003]植物环肽因其特殊的限制构想，其合成与线性肽相比要困难的多。截至目前植物环肽的生物合成途径已有了初步诠释。早期认为环肽的生物合成有两种途径，一种认为由基因编码经核糖体合成线性肽前体，再经剪切、环化及修饰形成成熟的环肽；另外一种认为环肽未经核糖体合成，而是通过非核糖体肽合成酶催化合成。随着研究的深入，越来越多的实验表明植物环肽合成为核糖体依赖型。
[0004]谭宁华等对植物环肽的研究发现脯氨酰内肽酶(prolyledopeptidase)不仅具有水解多肽的作用，同样也能逆反应方向合成肽键，在一定条件下，它可以将C端含有Pro的线性肽和另一端的氨基酸连接起来。2011年，Janet等从石竹科植物王不留行的EST中鉴定出11个编码环肽前体蛋白的候选基因，并利用农杆菌介导的过表达研究进行了功能验证，证实其为环肽前体蛋白的编码基因。随后，Barber等利用柱层析法从王不留行的萌发种子中分离出Oligopeptidase1(OLP1)和Peptide cyclase1(PCY1)；前者作用于线性肽前体N端并将其催化裂解形成中间产物，后者作用于C端催化C端的切割及环化形成环肽。Jennings等对茜草科植物白花蛇舌草cDNA测序，从cDNA序列中发现了编码环肽kalataB的前体，对kalate类型线性肽序列分析发现其末端的残基N(天冬酰胺)高度保守，推测天冬酰胺内肽酶asparaginylendopeptidase(AEP)可能执行剪切、环化等功能。环肽环化酶在其生物合成途中扮演着重要的角色，催化线性肽环化并最终得到环肽。
技术实现思路
[0005]本专利技术要解决的技术问题，本专利技术解决的技术问题是提供一种太子参环化酶phPCY、编码该环化酶的核苷酸序列、含有该酶核苷酸序列的表达载体，以及其在催化线性HB环化反应中的应用。
[0006]本专利技术通过下述方案实现：一种太子参环化酶蛋白基因，编码太子参环化酶phPCY的核苷酸序列如序列表1所示。
[0007]一种太子参环化酶蛋白基因，太子参环化酶phPCY的氨基酸序列如序列表2所示。
[0008]一种携带序列表2所述的基酸序列的表达载体。
[0009]太子参环化酶在催化线性底物HB生成环状HB环化反应中的应用。
[0010]一种太子参环化酶蛋白基因的获取包括以下过程：
[0011]过程一、构建太子参转录组数据库：提取太子参的总RNA，利用第三代高通量测序技术，通过Pacbio Sequel测序平台进行转录组测序，对测序数据进行富集、拼接、注释，构建太子参转录组数据库；
[0012]过程二、太子参环化酶基因的转录组数据库筛选：利用已经建立的太子参转录组数据库，以文献报道的王不留行环化酶pcy1序列为检索检索条件对太子参环化酶基因进行筛选，得到太子参环化酶phPCY基因序列(序列如序列表1所示)；
[0013]过程三、太子参环化酶基因的克隆与重组表达：根据筛选得到的太子参环化酶其环化酶phPCY基因序列设计特异性引物进行基因扩增，将得到的太子参环化酶phPCY目的基因PCR产物和PET系列(PET
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28a)表达载体进行重组连接。
[0014]太子参环化酶功能验证包括以下过程：
[0015]过程(1)纯化得到单一的环化酶phPCY：已经成功构建的太子参环化酶phPCY表达载体进行活化、转接、诱导得到含有该酶的菌体，对含有环化酶phPCY的菌体进行破碎、上柱纯化得到单一且有活性的环化酶phPCY；
[0016]过程(2)体外酶促反应：以前述(1)所得到的环化酶phPCY作为催化酶，合成的线性HB多肽作为底物，进行体外酶促反应；
[0017]过程(3)反应产物检测：对前述(2)的反应产物进行液相
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质谱检测。
[0018]本专利技术的有益效果为：使环化酶基因可以在大肠杆菌中表达；同时提供了含有所述氨基酸序列的蛋白表达载体，并能催化线性底物HB环化生成环状HB。
附图说明
[0019]图1是太子参RNA的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是DL2000 marker，1
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3是三个样品。
[0020]图2是太子参cDNA的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是DL2000 marker，1
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2是两个样品。
[0021]图3是太子参环化酶phPCY基因的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是DL2000 marker，1
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2是两个样品。
[0022]图4是环化酶phPCY蛋白电泳图，其中，M是Maker，1
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3分别是phPCY酶全细胞、粗酶液、纯化蛋白。
[0023]图5：太子参环化酶phPCY体外酶促反应产物在正模式下总离子流图。
[0024]图6：太子参环化酶phPCY体外酶促反应产物在正模式下质谱图。
具体实施方式
[0025]下面结合图1
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6对本专利技术进一步说明，但本专利技术保护范围不局限所述内容。
[0026]为了清楚，不描述实际实施例的全部特征，在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本专利技术由于不必要的细节而混乱，应当认为在任何实际实施例的开发中，必须做出大量实施细节以实现开发者的特定目标，例如按照有关系统或有关商业的限制，由一个实施例改变为另一个实施例，另外，应当认为这种开发工作可能是复杂和耗费
时间的，但是对于本领域技术人员来说仅仅是常规工作。
[0027]一种太子参环化酶蛋白基因的获取包括以下过程：
[0028]过程一、通过Plant RNA Kit提取试剂盒提取太子参块茎的RNA，具体步骤如下：
[0029]步骤(1)取适量
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80℃冻存太子参块茎置于预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨至粉末状；
[0030]步骤(2)取100mg粉末至1.5ml离心管中，加入500ul RCL Buffer并混匀，55℃孵育1
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3min；
[0031]步骤(3)室温10000xg离心5min；
[0032]步骤(4)收集上清液并转移至gDNA过滤本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种太子参环化酶蛋白基因，其特征在于：编码太子参环化酶phPCY的核苷酸序列如序列表1所示。2.根据权利要求1所述的一种太子参环化酶蛋白基因，其特征在于：太子参环化酶phPCY的氨基酸序列如...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈冲，
申请(专利权)人：福建艾普利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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