一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗。所述重组痘苗病毒是在痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上整合新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列，并在TK基因位置上整合新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列构建得到的；其中，蛋白E和M的编码基因序列以5

【技术实现步骤摘要】
一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗。

技术介绍

[0002]痘苗病毒(Vaccinia virus)是一类较大的有包膜的DNA病毒，早期即被用作预防天花的疫苗。因痘苗病毒基因组较大，对外源基因的容量大，及长期的使用历史等特点，目前以载体的形式用于抵抗感染性疾病的疫苗的构建，以及治疗性肿瘤疫苗和溶瘤病毒的载体。痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)是中国自主研发的成功用于预防天花的疫苗毒株，在我国天花的消灭过程中发挥了重要的作用。
[0003]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)与早期流行威胁公共健康的SARS
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CoV
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1、MERS同属于冠状病毒科β属，SARS
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CoV
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2基因组为单正链RNA，基因组大小约29.7kb，与SARS
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CoV
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1的序列相似性达79.6％。与SARS
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CoV
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1相似，SARS
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CoV
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2与宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶2(angiotensin
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converting enzyme
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2，ACE
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2)结合，诱导病毒囊膜和靶细胞膜融合，并释放病毒基因组。SARS
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CoV
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2主要编码四个结构蛋白：刺突蛋白S，核衣壳蛋白N，膜蛋白M，包膜蛋白E。这四个结构蛋白对SARS
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CoV
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2病毒颗粒结构的完整性起着至关重要的作用。S蛋白介导病毒与受体的结合；N蛋白与病毒基因组RNA结合形成核衣壳，参与病毒RNA的复制和病毒颗粒的组装；M蛋白是病毒颗粒中丰度最高的结构蛋白，与其它结构蛋白结合，促进子代病毒颗粒在细胞质ERGIC区的装配和形成；E蛋白参与病毒颗粒的装配和出芽。研究发现，SARS
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CoV
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1的S、N、E、M四个结构蛋白在细胞中共同表达后，能够产生自装配的病毒样颗粒(VLP)，这种病毒样颗粒不含有病毒的基因组，不具备感染性，但形态学上与SARS
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CoV
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1真病毒十分相似。近期对SARS
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CoV
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2的研究发现，共同表达SARS
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CoV
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2的S、N、E、M四个结构蛋白，也能够产生与真病毒十分相似的病毒样颗粒。由于病毒样颗粒在形态上与真病毒的高度相似性，以病毒样颗粒为靶标设计的疫苗，其有效性可能超越针对病毒单一组分如S蛋白的疫苗。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗(新冠病毒疫苗)。
[0005]本专利技术在痘苗病毒天坛株的基础上建立了一种可形成新冠病毒样颗粒的新型冠状病毒疫苗，基于我国自主研发的天花疫苗株痘苗病毒天坛株，缺失TK区导入新冠的S、N蛋白编码基因序列，同时缺失F4L区导入新冠病毒E和M编码基因序列，构建能够同时表达新冠病毒S、N、E、M四种结构蛋白的重组病毒TK
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SN/F4L
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EM。将此重组病毒免疫小鼠，在小鼠血清中检测到较高的S、N特异性抗体滴度，免疫后可诱导抗原特异的T细胞免疫反应。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种重组痘苗病毒，所述重组痘苗病毒是在痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上整合新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码
基因序列，并在TK基因位置上整合新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列构建得到的；其中，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和膜蛋白M的编码基因序列以5
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端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游；所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和核衣壳蛋白N的编码基因序列以5
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端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游。
[0007]优选地，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述膜蛋白M的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游，所述刺突蛋白S的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述核衣壳蛋白N的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游。
[0008]进一步地，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和启动子P7.5以及膜蛋白M的编码基因序列和启动子P11以串联方式连接，所述串联后的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]进一步地，所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和启动子P7.5以及核衣壳蛋白N的编码基因序列和启动子P11以串联方式连接，所述串联后的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]第二方面，本专利技术提供所述重组痘苗病毒的制备方法，所述方法包括：将新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列以同源重组的方式整合于痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上，并将新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列以同源重组的方式整合于TK基因位置上。
[0011]进一步地，以携带有痘苗病毒F4L基因同源左臂和同源右臂的穿梭质粒作为新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列的DNA载体。
[0012]进一步地，以携带有痘苗病毒TK基因同源左臂和同源右臂的穿梭质粒作为新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和核衣壳蛋白N的编码基因序列的DNA载体。
[0013]优选地，F4L区穿梭质粒为pF4L(pF4L全序列如SEQ ID NO:3所示)，含有以下元件：
①
F4L基因区同源左臂和同源右臂，是痘苗病毒和穿梭质粒发生同源重组的同源序列；
②
痘苗病毒的启动子P7.5，用以启动其下游基因的转录；
③
痘苗病毒的启动子P11，用以启动其下游基因的转录。
[0014]TK区穿梭质粒为pTK(pTK全序列如SEQ ID NO:4所示)，含有以下元件：
①
TK基因区同源左臂和同源右臂，是痘苗病毒和穿梭质粒发生同源重组的同源序列；
②
痘苗病毒的启动子P7.5，用以启动其下游基因的转录；
③
痘苗病毒的启动子P11，用以启动其下游基因的转录。
[0015]第三方面，本专利技术提供一种新冠病毒疫苗，其有效成分为所述的重组痘苗病毒。
[0016]第四方面，本专利技术提供所述重组痘苗病毒在制备新冠病毒疫苗中的应用。
[0017]第五方面，本专利技术提供所述重组痘苗病毒在制备用于诊断新冠病毒感染的检测试剂或试剂盒中的应用。
[0018]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组痘苗病毒，其特征在于，所述重组痘苗病毒是在痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上整合新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列，并在TK基因位置上整合新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列构建得到的；其中，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和膜蛋白M的编码基因序列以5
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端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游；所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和核衣壳蛋白N的编码基因序列以5
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端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游。2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述膜蛋白M的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游，所述刺突蛋白S的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述核衣壳蛋白N的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游。3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和启动子P7.5以及膜蛋白M的编码基因序列和启动子P11以串联方式连接，所述串联后的序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭斐，秦川，许丰雯，鲍琳琳，梅珊，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：