一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70-P113融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70
‑
P113融合蛋白


[0001]本专利技术属于重组蛋白
，具体涉及一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70
‑
P113融合蛋白。

技术介绍

[0002]绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Movi）是引起绵羊和山羊的支原体性肺炎的主要病原之一，呈世界性分布，给世界羊养殖业带来了巨大经济损失。绵羊肺炎支原体的治疗以抗生素为主，然而抗生素导致的耐药性使得绵羊肺炎支原体的治疗效果不理想，所以绵羊肺炎支原体应以预防为主。然而目前国内Movi的疫苗主要是灭活苗，以全菌抗原灭活为主。然而，不同地方流行的支原体具有遗传多样性，菌株之间交叉保护力低，另外Movi体外培养产量相对较低，耗时，全菌抗原存在安全隐患，所以研发高效、安全的Movi新型疫苗是近年的趋势。亚单位疫苗存在安全性高，无核酸、不散毒、不返强，而且抗原组分单一、纯度高，疫苗产量高等优点已成为疫苗发展的趋势。而绵羊肺炎支原体（Movi）还未有商品化亚单位疫苗。目前许多研究集中在通过抗原表位鉴定筛选具有良好免疫原性的蛋白，用于制备亚单位疫苗。P113为黏附素，黏附素是支原体重要的毒力因子也是最为重要的免疫原，是引起机体产生免疫应答的主要蛋白，热休克蛋白HSP70是机体内高度保守的生物分子，也是Movi重要的膜蛋白，具有免疫原性和免疫佐剂效应，其C末端抗原性优势明显，可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫反应。本专利技术通过筛选HSP70基因以及MO ATCC 29419分离株的P113基因中的优势抗原区域，将两个优势抗原区域的基因序列进行稀有密码子优化，并在两个基因序列中间加上连接子（GGGGSGGGGS），再复制到pET
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30a(+)原核表达载体上，命名为HSP70
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P113
‑ꢀ
pET
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30a(+)。经过诱导表达，纯化蛋白，免疫小鼠，通过Western Blot试验证明HSP70
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P113重组蛋白有免疫原性，可为绵羊肺炎支原体亚单位疫苗的开展提供基础。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白，所述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白的氨基酸序列为SQE ID NO.2所示的序列。
[0005]一种编码上述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白的融合基因，所述的融合基因为使用连接子（GGGGSGGGGS）将绵羊肺炎支原体热休克蛋白基因HSP70和绵羊肺炎支原体黏附素基因P113拼接而成，其核苷酸序列为SQE ID NO.1所示的序列。
[0006]一种大肠杆菌表达质粒载体，所述的质粒载体是由上述的融合基因插入至质粒pET
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30a的Nde I和BamH I位点之间来构建的，所述的大肠杆菌是BL21（DE3）。
[0007]一种用于生产上述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白的大肠杆菌菌株，所述
的大肠杆菌菌株含有上述的质粒载体，所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。
[0008]一种制备上述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白的方法，包括以下步骤：1）将序列如SQE ID NO.1所示的融合基因插入大肠杆菌质粒pET
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30a的Nde I和BamH I位点之间，将该质粒转化大肠杆菌获得含有HSP70
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P113
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pET
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30a(+)的菌株，接种培养，IPTG诱导表达；2）表达菌体经离心裂解后，收获包涵体，用PBS缓冲液重悬，离心，取上清进行Ni
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NTA亲和层析，获取绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白；其中，所述的大肠杆菌是BL21（DE3）。
[0009]上述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白在制备绵羊肺炎支原体亚单位疫苗方面的应用。
[0010]本专利技术的显著优点在于：本专利技术首次选取具有免疫原性和免疫佐剂效应的HSP70以及具有良好免疫原性的粘附素P113，通过选择这两个基因的优势抗原区域进行密码子优化，成功表达了HSP70
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P113重组蛋白，并且其具有强的免疫原性，为绵羊肺炎支原体亚单位疫苗的开展提供基础。另外HSP70
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P113重组蛋白具有免疫原性还可以与绵羊肺炎支原体阳性血清发生反应，同时为绵羊肺炎支原体的间接ELISA方法等血清学方法的建立提供抗原，是ELISA试剂盒的最核心成分。
附图说明
[0011]图1为HSP70
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P113
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pET
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30a(+)的质粒图谱。
[0012]图2为HSP70
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P113融合蛋白的可溶性表达与包涵体表达。泳道M：Protein marker；泳道PC1：BSA (1μg)；泳道PC2：BSA (2μg)；泳道NC：未诱导的全细胞样品；泳道1：15℃诱导16h的全细胞样品；泳道2：37℃诱导4 h的全细胞样品；泳道NC1：未诱导的细胞裂解上清样品；泳道3：15℃诱导16h的细胞裂解上清样品；泳道4：37℃诱导4 h 的细胞裂解上清样品；泳道NC2：未诱导的细胞裂解沉淀样品；泳道5：15℃诱导16h的细胞裂解沉淀样品；泳道6：37℃诱导4 h的细胞裂解沉淀样品。
[0013]图3为纯化后的HSP70
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P113融合蛋白的SDDS
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PAGE凝胶电泳分析结果。泳道M：Protein marker；泳道1：纯化的HSP70
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P113融合蛋白。
[0014]图4为HSP70
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P113融合蛋白的免疫原性分析结果。泳道M：Protein marker；A：一抗为鼠抗HSP70
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P113多克隆抗体；B：一抗为鼠抗Movi多克隆抗体；C：一抗为正常对照小鼠血清（空白对照）。
具体实施方式
[0015]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0016]实施例1HSP70
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P113融合基因设计及合成利用DNAStar7.0软件中的Protean软件分析绵羊肺炎支原体FJ
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01CL分离株的热休克蛋白基因HSP70以及绵羊肺炎支原体ATCC 29419分离株的黏附素基因P113中的优势抗原区域，将得到的两个优势抗原区域的基因序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫原性的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白，其特征在于：所述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白的氨基酸序列为SQE ID NO.2所示的序列。2.一种编码权利要求1所述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白的融合基因，其特征在于：所述的融合基因的核苷酸序列为SQE ID NO.1所示的序列。3.一种大肠杆菌表达质粒载体，其特征在于：所述的质粒载体是由权利要求2所述的融合基因插入至质粒pET
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30a的Nde I和BamH I位点之间来构建的。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达质粒载体，其特征在于：所述的大肠杆菌是BL21（DE3）。5.一种用于生产权利要求1所述的绵羊肺炎支原体HSP70
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P113融合蛋白的大肠杆菌菌株，其特征在于：所述的大肠杆菌菌株含有权利要求3所述的质粒载体。6.根据权利要求5所述的大肠杆菌菌株，其特征在于：所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。7.一种制备权利要求1所述的绵羊肺...

【专利技术属性】
技术研发人员：江锦秀，胡奇林，林裕胜，张靖鹏，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：