一种基因修饰NK细胞与抗体联合使用治疗肿瘤方案制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种基因修饰NK细胞与抗体联合使用治疗肿瘤方案。具体地，本发明专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括CD8a蛋白上膜信号、CD64蛋白FC识别功能区域、CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列、2B4蛋白胞内信号转导序列。最优选地，表达所述融合蛋白的NK细胞具有更强的杀伤活性。融合蛋白的NK细胞具有更强的杀伤活性。融合蛋白的NK细胞具有更强的杀伤活性。

【技术实现步骤摘要】
一种基因修饰NK细胞与抗体联合使用治疗肿瘤方案


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种基因修饰NK细胞与抗体联合使用治疗肿瘤方案。

技术介绍

[0002]由于NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)的杀伤活性无MHC限制，因此称为自然杀伤活性。与T细胞和B细胞不同，NK细胞不需要特异性的抗原致敏刺激就可识别并杀伤靶细胞，NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。
[0003]NK细胞的靶细胞主要包括某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素。NK细胞杀伤靶细胞的主要机制：1、通过释放穿孔素和颗粒酶引起细胞溶解；2、通过配体诱导的受体介导的凋亡激活途经引起靶细胞的凋亡；3、释放细胞因子(包括：NK细胞细胞毒因子、NK细胞肿瘤坏死因子)杀伤靶细胞；4、抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody
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dependent cell
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mediated cytotoxicity)。
[0004]当抗体通过抗原结合部位结合肿瘤细胞表面抗原以及Fc部位结合免疫效应细胞表面Fc受体时，免疫效应细胞得到激活，杀死肿瘤细胞，这个过程称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。Fc受体主要有三种：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)，其中后两种又可分为：FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb。不同的免疫细胞表达特定的Fc受体，如中性粒细胞通常表达FcγRI、FcγRII、FcγRIIIb，而NK细胞只表达FcγRIIIa。FcγRIIIa通常认为是引起ADCC的关键受体，所以虽然NK细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞都可以产生ADCC作用，但是NK细胞被认为是最重要的细胞种群。
[0005]ADCC强弱跟许多因素有关，比如抗体与抗原的亲和力，抗体与Fc受体的亲和力、肿瘤抗原的密度、肿瘤靶细胞的特性以及免疫效应细胞的特性等。一般情况下，肿瘤靶细胞与免疫效应细胞通过抗体的桥联结合越紧密，ADCC作用越强。因此，对抗原或Fc受体亲和力高的抗体介导的ADCC作用更强。表达靶抗原高的肿瘤细胞对ADCC更为敏感，容易被ADCC作用所杀死。
[0006]NK细胞在肿瘤部位的浸润程度也对免疫治疗的效果有影响，NK细胞向肿瘤内部募集可有效改善抗肿瘤免疫应答。肿瘤微环境中的趋化因子和黏附因子等，通过募集NK细胞，促使肿瘤组织中NK浸润程度增加，继而使得NK细胞表面活化受体识别肿瘤细胞表面相应配体，释放穿孔素等杀伤介质，发挥抗肿瘤的细胞毒性作用。
[0007]NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，已有研究验证了其对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效，NK细胞疗法将在未来肿瘤免疫治疗中扮演重要的角色。随着肿瘤发病率的逐年提高，寻找一种高效、无毒副作用的治疗方法是是医生和患者共同的努力方向。NK细胞疗法既可单独用于治疗，亦可联合其他治疗方式用于各种癌症的治疗，具有极高的应用前景。

技术实现思路

[0008]为进一步提高NK细胞的杀伤作用，本专利提供了一种基因修饰的NK细胞，所述基因修饰的NK细胞相较于普通的NK细胞有更强的杀伤作用；进一步地，与抗体联合使用时，本专利技术所述的基因修饰的NK细胞识别抗体的Fc端，通过抗体识别特异性靶点，表达对肿瘤细胞的强杀伤效果。
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括CD8a(即CD8α)蛋白上膜信号、CD64蛋白FC识别功能区域、CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列、2B4蛋白胞内信号转导序列。
[0010]在一种实施方式中，所述融合蛋白由CD8a蛋白上膜信号、CD64蛋白FC识别功能区域、CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列、2B4蛋白胞内信号转导序列组成。
[0011]在一种实施方式中，所述CD8a蛋白上膜信号的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:1所示。
[0012]在一种实施方式中，所述CD64蛋白FC识别功能区域的氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:2所示。
[0013]在一种实施方式中，所述CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列的氨基酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:3所示。
[0014]在一种实施方式中，所述2B4蛋白胞内信号转导序列的氨基酸序列与SEQ ID NO.:4所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:4所示。
[0015]在一种最优选地实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列即SEQ ID NO.:1、2、3、4依次连接所构成。
[0016]另一方面，本专利技术提供了编码前述融合蛋白的多核苷酸。
[0017]在一种实施方式中，所述CD8a蛋白上膜信号的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
[0018]在一种实施方式中，所述CD64蛋白FC识别功能区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
[0019]在一种实施方式中，所述CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
[0020]在一种实施方式中，所述2B4蛋白胞内信号转导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示。
[0021]也即，最优选地，本专利技术所提供的多核苷酸是SEQ ID NO.:5、6、7、8依次连接所构成。
[0022]如本文所用的，术语“多核苷酸”包括单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。术语“核酸”包括任何核酸类型，如DNA或RNA。
[0023]另一方面，本专利技术提供了含有前述多核苷酸、或表达前述融合蛋白的载体。
[0024]在一种实施方式中，所述载体包含慢病毒载体(慢病毒表达载体)、逆转录病毒载体(逆转录病毒表达载体)、腺病毒载体(腺病毒表达载体)。
[0025]如本专利技术实施例所使用的，所述载体是慢病毒载体，例如常规载体pRSV
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Rev(Plasmid#12253)、pMDLg/pRRE(Plasmid#12251)、pMD2.G(Plasmid#12259)。
[0026]如本文所用的，术语“载体”可指引入宿主细胞的核酸分子，从而产生转化的宿主
细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可以包括一种或多种可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元件。此处设想的特定类型的载体可以与病毒缔合或掺入病毒中，以促进细胞转化。
[0027]在一种实施方式中，所述载体是成熟的商品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括CD8a蛋白上膜信号、CD64蛋白FC识别功能区域、CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列、2B4蛋白胞内信号转导序列中至少多种；优选地，所述融合蛋白由CD8a蛋白上膜信号、CD64蛋白FC识别功能区域、CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列、2B4蛋白胞内信号转导序列组成、或所述融合蛋白由CD64蛋白FC识别功能区域、CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列组成；优选地，所述CD8a蛋白上膜信号的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:1所示；优选地，所述CD64蛋白FC识别功能区域的氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:2所示；优选地，所述CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列的氨基酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:3所示；优选地，所述2B4蛋白胞内信号转导序列的氨基酸序列与SEQ ID NO.:4所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变，或如SEQ ID NO.:4所示；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列即SEQ ID NO.:1、2、3、4依次连接所构成。2.编码权利要求1所述融合蛋白的多核苷酸；优选地，所述融合蛋白中CD8a蛋白上膜信号的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示；优选地，所述融合蛋白中CD64蛋白FC识别功能区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示；优选地，所述融合蛋白中CD16蛋白跨膜结构及胞内信号转导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示；优选地，所述融合蛋白中2B4蛋白胞内信号转导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示；最优选地，所述多核苷酸是SEQ ID NO.:5、6、7、8依次连接所构成。3.表达权利要求1所述融合蛋白，或含有权利要求2所述多核苷酸的载体；优选地，所述载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体。4.一种基因修饰的宿主细胞，所述宿主细胞中含有或表达权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述载体中的一种或多种；优选地，所述宿主细胞是来自于受试者的自体细胞、或异体细胞；优选地，所述受试者包括人、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、熊；优选地，所述宿主细胞包括干细胞、免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、K细胞和NK细胞中的一种或多种；优选地，所述免疫细胞是NK细胞；优选地，所述干细胞是诱导性多能干细胞。5.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述载体、权利要求4所述宿主细胞中的一种或多种；优选地，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、混悬剂、注射剂、微球或脂质体；优选地，所述药物组合物还可以包含一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体包括但不限于马妥昔单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、他尼珠单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、培化阿珠单抗、阿麦妥昔单抗、阿泊珠单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、莫
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比伐珠单抗、贝伦妥单抗
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维多汀、莫坎妥珠单抗、拉坎妥珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、泊西他珠单抗、西妥木单抗、可那木单抗、达西珠单抗、达洛珠单抗、地莫单抗、依美昔单抗、依决洛单抗、依洛珠单抗、恩司昔单抗、依帕珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、格莱木单抗
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维多汀、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、拉英达西单抗、英妥木单抗、伊珠单抗奥佐米星、伊匹木单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、莫洛伏珠单抗。7.一种制备高杀伤活性的宿主细胞的方法，所述方法包括以下任意一种：1)权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述载...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹乐，顾雨春，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技珠海横琴新区有限公司，
类型：发明
国别省市：